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一项关于外周血白细胞深度剖析的探索性研究,以确定对强直性脊柱炎中抗肿瘤坏死因子α疗法反应的预测因子:重点关注的自然杀伤细胞

国际前沿|来源:BMC|作者:Ursula Schulte-Wrede,直到S... 评论(0)

关键词

  • 强直性脊柱炎
  • 依那西普
  • CD8 + NK细胞
  • TNF-α阻断剂
  • 预测生物标志物

背景

强直性脊柱炎(AS)是一种多因素慢性炎症性风湿性疾病,属于称为脊柱关节炎(SpA)的风湿性疾病,主要影响轴向骨骼[ 1 ]。AS在欧洲人群中的患病率约为143万[ 2 ],青春期发病[ 3 ],男性发病率比女性高2倍[ 4 ]。AS的发病机制仍然模糊不清; 假设AS主要由两种遗传因素引起,这意味着主要组织相容性复合物(MHC)I抗原人白细胞抗原B27(HLA-B27)的表达[ 5 ],以及环境因素如肠杆菌抗原[ 6]。为了缓解AS患者的轴性症状,非甾体抗炎药(NSAID)作为一线治疗提供。阻断疗法的抗肿瘤坏死因子(TNF)仅在患者不断高疾病活性谁是非响应于常规NSAID治疗应用[ 7,8 ]。目前,有五种抗TNF-α药物被批准用于治疗AS:英夫利昔单抗[ 9 ],一种单克隆嵌合抗体; 依那西普,一种可溶性人TNF受体(sTNFR)2融合蛋白[ 10 ]; adalimumab,一种人源化单克隆抗体[ 11 ]; golimumab,一种完全人类单克隆抗体[ 12 ]; 和certoluzimab,人源化单克隆抗体的Fab片段[13 ]。大多数这些生物制剂也成功地用于类风湿性关节炎(RA),牛皮癣(Pso),青少年炎性关节炎(JIA)和炎性肠病(IBD)。TNF-α的生物学功能是通过与膜受体TNFR1(p55)或TNFR2(p75)结合而介导的。虽然TNFR1在所有淋巴和骨髓免疫细胞和体细胞中普遍表达[ 14 ],但TNFR2的表达主要限于T细胞[ 15 ]和自然杀伤(NK)细胞[ 16 ]。此外,TNFR2可以在内皮细胞和间充质细胞,中枢神经系统细胞(CNS),少突胶质细胞和心肌细胞[ 17 ]以及其他一些细胞类型[ 18 ]中表达[ 18]。]。根据其功能,TNFR1主要与促凋亡过程相关,而TNFR2负责确保细胞存活的过程[ 19 ]。

尽管靶向TNF-α在AS中非常有效,但约三分之一的治疗患者仅表现出较差的反应,这可部分归因于抗药物抗体(ADAb)的发展,导致生物利用度降低[ 20 ]。交换成另一种抗TNF药物的最可能的先决条件是有效性的部分或全部失败以及副作用[ 21]。关于这些不良反应和抗TNF剂的高成本导致对医疗保健系统的高经济负担,期望在生物治疗之前根据治疗预测因子对患者进行分层。各种人口统计和临床参数,如高基线疾病活性,短病程,年轻的年龄,男性,和HLA-B27的存在已经显示出与临床足够的短期和长期响应[相关联22,23,24,25,26 ]。此外,现代成像技术,如磁共振成像(MRI),用于将骨骼和组织破坏与治疗反应相关联[ 27]]。然而,当用作标准的预处理评估时,这些技术耗时且昂贵。当对抗TNF剂的反应性与不同TNF-α基因型的存在相关时,研究了另一水平的治疗反应预测。据报道,患者TNF-α-308 G / G,-857 C / C,或-1031 T / T基因型显示出抗TNF剂比患者更好的反应在没有这些多态性[ 28,29]。除了这些观察结果外,AS中没有可靠的抗TNF反应性预测生物标志物。使用多参数流式细胞仪方法,我们旨在识别AS患者外周血中基于细胞的生物标志物,这些生物标志物能够在开始治疗前预测对TNF抑制剂的成功治疗反应。结果,我们发现表达CD8的NK细胞亚群的低预治疗频率与缺乏治疗反应相关。

方法

主题

道德声明

该研究是根据1964年的赫尔辛基宣言进行的,并由CharitéLabenMitte的Charité大学医学伦理委员会I批准。所有患者均提供书面知情同意书以参与该研究。此外,我们声明此手稿中不包含任何可能导致识别研究参与者的信息或图像。

共有31名AS患者(22名男性,9名女性),其中81%为HLA-B27阳性,从Charité的风湿病门诊诊所招募,10名健康对照(HC; 7名男性,3名女性)参加了研究。患者的平均年龄为38±10.2岁,HC平均为34±10.7岁。所有患者均符合修订后的纽约标准[ 30 ]并且由于持续高的疾病活动(Bath强直性脊柱炎疾病活动指数(BASDAI)> 4)符合抗TNF抑制剂治疗的资格,尽管使用NSAID治疗或无法服用由于禁忌症引起的NSAID包括在研究中(表  1)。根据BASDAI指数评估疾病活性,该指数由0(无症状)至10(高疾病活动)的评分范围组成。TNF抑制剂治疗前的平均基线BASDAI为6.2±1.3(表  1)。

表格1 分别用ETN和ADA治疗的AS患者的人口统计学和疾病特征

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除非另有说明,否则结果显示为平均值±SD

ADA阿达木单抗,AS强直性脊柱炎,BASDAI Bath强直性疾病活动指数,BASDAI红。治疗1-6个月后BASDAI减少百分比,BASDAI50百分比BASDAI减少50%,CRP C反应蛋白,DD疾病持续时间,ESR红细胞沉降率,ETN依那西普,F女性,HLA人白细胞抗原,M男性,NR无反应者,R反应者

在TNF抑制剂治疗开始之前,取10ml肝素化血液进行流式细胞术分析。15名患者接受依那西普(Enbrel; Amgen和Pfizer)治疗,16名患者接受阿达木单抗治疗(Humira; AbbVie Inc.)。BASDAI评分在基线和随访时获得[ 31 ]。在治疗开始后1至6个月评估对治疗的反应,并定义为相对于基线BASDAI的50%BASDAI减少(BASDAI50反应)(附加文件  1:表S1)。

血液样品制备,抗体染色和流式细胞术测量

血样制备和抗体染色程序如前所述[ 32 ]。在治疗前从患者血液中获得的细胞在七色染色中对50种不同的表面抗原进行染色,组合至10个管(表  2)。染色后,用1%多聚甲醛固定细胞,并在24小时内分析。我们没有包括活/死细胞染色,但根据其SSC / FSC特征排除细胞碎片,红细胞和血小板。

表2染色基质显示在十个单独的染色管中测量的抗体及其相应的荧光染料缀合物

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T1-T10代表各自的染色管

用FACSCanto TM II流式细胞仪(BD Biosciences,USA)完成数据采集,每个样品的平均细胞计数为一百万个细胞。为了保证仪器的可重复性和测量仪器的性能,每次测量前都会定期使用BD™细胞仪设置和跟踪珠。此外,我们始终通过监测每个特定染色管使用的每个荧光通道,在数据采集后直接监测抗体染色的质量。为此绘制了20,000个随机选择的事件。未通过此质量检查的样品被排除在进一步分析之外。

数据分析和统计分析

应用两种不同的软件工具来分析由这种无监督的流式细胞术方法生成的复杂数据集,该方法基于手动和自动生物信息学策略识别潜在的候选表型。在第一种方法中,平均荧光强度(MFI)和手动分析数据的绝对细胞数等相关统计数据以逗号分隔值(CSV)文件格式传输到Access数据库,如前所示[ 32]。包括颜色补偿和门设置的该主要数据分析由FACSDIVA v6.0软件(BD Biosciences,USA)进行。第二种方法使用自动分类算法immunClust,它处理未补偿的原始数据,因此排除任何依赖于操作者的门控或补偿伪影[ 33 ]。免疫污染的群体聚类和比较元聚类假设有限混合模型并使用具有综合分类似然(ICL)标准的期望最大化(EM) - 项目来稳定合理聚类的数量。对于元聚类,发明了基于Bhattacharyya系数的高斯分布的概率测度。对Meta集群进行手动注释和分类。

使用Prism 5(GraphPad Software,Inc。)进行的线性回归和接收器操作特征(ROC)分析用于阐明候选标记和临床参数之间的关联。对于统计数据分析,使用Welch校正t检验,其中p值<0.05被确定为具有统计学意义。

结果

患者基线特征及其临床反应

研究设计包括具有高疾病活动性的31名AS患者,在用阿达木单抗(ADA; n  = 16)或依那西普(ETN; n  = 15)治疗之前,基线BASDAI为6.2±1.3 。患者人口统计学和基线临床特征总结在表  1中,并且显示ADA和ETN治疗的患者之间没有显着差异。

BASDAI评估的平均日期为治疗开始后3.1±1.4个月。治疗1至6个月后,对于ETN治疗的患者,BASDAI评估的疾病活动相对减少为51.1±31.7%,接受ADA的患者为44.3±31.6%。根据BASDAI反应标准,ETN组中的5名患者和ADA组中的7名患者未响应(附加文件  1:表S1)。

在基线时可获得的临床参数,例如疾病持续时间,基线BASDAI,C-反应肽(CRP)水平和红细胞沉降率(ESR),以及HLA-B27的表达,不允许对应答的患者进行区分。 TNF-α阻滞剂和那些会失败的人。

对于数据分析,我们应用了一种无监督的自动化细胞聚类方法immunClust [ 33 ],以确定潜在的免疫表型参数,这些参数能够在抗TNF治疗之前将AS患者分为应答者(R)和非应答者(NR)。由于新鲜获得的患者血液立即被处理,我们没有进行死细胞染色,但我们分别根据由前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)特征定义的细胞大小和粒度门控活细胞。

所呈现的二维聚类方法使患者聚集在垂直方向,并且在水平方向聚类的免疫表型参数给出了所有白细胞亚群的概述,包括在R和NR中差异表达的某些活化标记。为了通过immunClust算法鉴定重要参数,使用未补偿原始数据的FCS文件(流式细胞术标准文件格式),并且当考虑所有患者样品时最终公开36个参数。分析ETN和ADA治疗的患者分别显示21和27个参数(图  1)。

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图1 了在R和NR处理之前考虑所有患者时差异表达的免疫表型参数的二维系统聚类分析(),依那西普(ETN)单独(b),和阿达木单抗(ADA)单独(Ç)列代表个体患者,垂直树状图下方的颜色代码表示响应者(分别为蓝色)或无应答者(非R;红色)和使用的TNF阻断剂(ETN(青色)或ADA(粉红色))。簇图的行代表p的免疫表型参数值<0.1。参数表达的大小用红色进行颜色编码,相对增加,蓝色表示相对减少。水平树状图的颜色代码表示特定细胞类型的表达,如自然杀伤(NK)细胞(青色),B细胞(绿色),T细胞(覆盆子红色),单核细胞(mo;橙色),粒细胞(gr;蓝色)和CD3阴性淋巴细胞(CD3-白色)。总的来说,每个样本获得了一百万个细胞,以确保甚至可以可靠地检测到频率约为0.1%的稀有细胞群


虽然使用所有这些参数不允许R和NR的无差错分类,但是所有样品被分组为两个主要的簇,其分别富集R和NR(图  1a)。令人惊讶的是,如果所有患者一起进行分析,超过50%的鉴别参数可以明确地分配给NK细胞亚群(图  1a)。为了进一步分析NK细胞相关亚群,并且知道ETN和ADA具有不同的作用模式来中和TNF-α的作用,我们继续分别研究两个治疗组以鉴定治疗特异性反应特征。使用这种方法,大多数参数可以显着区分ETN组(图1b)和ADA组(图1c)  中的NR和R. )与NK细胞室有关。在ETN治疗的患者组中实现了R和NR的最佳分类。这里,10个R中只有两个被分组为NR,一个单个的5个NR被分组为R.

验证经典NK细胞和CD8阳性NK细胞作为抗TNF-α治疗预测的潜在免疫生物标志物

由于典型的经典NK细胞的百分比分布以及特别是CD8阳性和CD8阴性NK细胞的比例似乎是抗TNF治疗反应的最有希望的预测因子,我们研究了NK上的CD8受体表达。细胞更详细。在图  2中,显示了定义经典CD56 暗淡 CD16 + NK细胞的一般门控策略。在附加文件  2(图S1)中,单核细胞和NK细胞的背景证明,尽管用相同的荧光染料(CD14 / CD56 / IgD标记为PE)标记了多种抗原,但是对于NK细胞,单核细胞,这些复杂染色的解开, T细胞和B细胞是可能的。

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图2用于鉴定CD8阳性和CD8阴性NK细胞亚群的代表性门控策略。为了增加在单个七色染色设置中可检测的参数多样性,我们组合了由相同荧光染料标记的特异性表达的细胞谱系标志物,例如CD14-PE / CD56-PE / IgD-PE。其细胞特异性表达可以通过顺序选通由所例示被去卷积一个:(左图)门控小型小区(G1)与根据FSC / SSC特性低粒度允许单核细胞(CD14)和粒细胞(CD16)的排斥; (中图)CD31和T淋巴细胞通过CD3(G2)排除B淋巴细胞; 和(右图)分析CD19 / CD3-双阴性细胞的CD56对CD16,使我们能够通过CD56和CD16(G3)的共表达鉴定NK细胞。b 根据它们在五个示例性应答者(R;顶行)和无应答者(NR;底行)中的CD8受体的表达进一步分析经典NK细胞。


首先,设置淋巴细胞散射门(G1)(图  2a)。接下来将T细胞和B细胞排除在淋巴细胞群(G2)之外以确定CD56 暗淡 CD16 + NK细胞(G3)的百分比。随后,通过子门控定量CD8阳性NK细胞,如五个应答者(R2,R9,R16,R12和R18)和五个无应答者(NR1,NR7,NR8,NR10和NR12)的示例性示例(图  2b)。

图  3显示健康对照(n  = 10),抗TNF R(n  = 19)和抗TNF NR(n  = 12)的CD8阳性NK细胞的频率。与NR相比,在R组中观察到显着更高频率的携带CD8受体的NK细胞(图  3)。比较CD8阳性NK细胞与HC的百分比,不响应的AS患者显示出表达CD8的NK细胞的频率显着降低(图  3)。NK细胞和CD8阳性子集的频率和绝对计数的各个值在附加文件1中给出  (表S1)。

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图3在治疗前对所有患者或阿达木单抗(ADA)和依那西普(ETN)分别评估响应者(R)和非应答者(NR)中CD8阳性自然杀伤(NK)细胞的频率。意义由韦尔奇的校正t检验确定。HC健康控制

接下来,我们进行了Spearman等级相关和线性回归分析,如果包括所有31名患者,则显示经典NK细胞频率的显着负相关和改善的治疗结果(图  4a ; p  = 0.01,2  = 0.19)。

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图4线性回归和Spearman等级相关分析显示在用ADA和ETN(n  = 31)治疗后1至6个月内Bath强直性脊柱炎疾病活动指数(BASDAI)值的相对减少,与经典自然杀手(NK)的频率变化相关细胞(a)和CD8阳性NK细胞(b)。根据曲线下面积(AUC)值,所有患者的ROC曲线显示经典(c)和CD8表达NK细胞(d)的值作为预后标志物

令人惊讶的是,当我们专注于表达CD8的NK细胞的分析时,发现了正的线性相关性(图  4b)。在此,与总NK细胞(G3)的细胞相关的CD8阳性细胞的频率与成功的治疗反应明显相关。当考虑所有患者时,这种相关性具有统计学意义(p  = 0.002,2  = 0.29)。

此外,进行通过ROC曲线显示的逆向回归分析以验证经典和特别是CD8阳性NK细胞的质量,作为用于预测抗TNF治疗结果的合适的细胞生物标志物(图  4c,d)。如果包括所有样品用于该分析,则经典NK细胞的频率是作为基线预测因子的最有希望的参数(图  4c ; p  = 0.008,曲线下面积(AUC)= 0.79)。如果使用CD8阳性NK细胞的频率,则获得略微改善的值(图  4d ; p = 0.007,AUC = 0.79)。因此,我们的数据暗示CD8阳性NK细胞的出现是用于预测基线时抗TNF-α应答的稳健生物标志物。

讨论

据我们所知,这是第一项旨在鉴定外周血细胞生物标志物的研究,以便随后对抗TNF-α治疗的反应性对AS患者进行分层。迄今为止,还没有可用的可量化的实验室参数可用于个性化的响应预测[ 34 ]。虽然较高的CRP,ESR和血清淀粉样蛋白A(SAA)值以及HLA-B27的存在已被报道为AS中成功的抗TNF-α治疗反应的有用基线预测因子,其稳健性,灵敏度和特异性失败,如果施加到个别患者[ 35,36]。甚至我们的数据,例如患者年龄,疾病持续时间,CRP水平或血液沉降,也不允许对未来的反应性进行任何预测。

其他潜在的新生物标志物,如单核苷酸多态性(SNPs)和内质网氨肽酶活性(ERAP)-1 [ 37 ],血清基质金属蛋白酶(MMP)-3 [ 38 ]或血管内皮生长因子(VEGF) )[ 39 ],尚未达到AS临床诊断常规的标准。通常,将可量化参数与疾病活动BASDAI评分相关联是具有挑战性的,该评分是基于患者对幸福感的主观评估来计算的,因此当用作绝对变量时仅具有有限的值。

在我们的探索性研究中,我们使用了一种集成的多参数流式细胞仪和一种新的无监督数据聚类方法来识别在响应者和非响应者中定性或定量不同的可能的细胞生物标记物。类似的方法已经成功地用于根据血液中特定的表型变化对来自健康供体的活动AS患者进行分类[ 32 ]。Alegria等人给出了迄今为止描述的不同自身免疫疾病中免疫表型变化的综合概述。[ 40 ]。

原则上,在第一种观点,主要CD56 暗淡 CD16 + NK细胞亚群的频率增加表明治疗性抗TNF抗体反应较弱。该发现与其他报道一致,其显示先天免疫,特别是NK细胞可以以保护性和致病性方式在各种自身免疫疾病的发病机理中发挥核心作用。他们的频率和功能在慢性炎症中进行了研究,如类风湿性关节炎[ 41 ],多发性硬化[ 42 ],牛皮癣[ 43 ]和系统性红斑狼疮[ 44]。]。尽管存在一些相互矛盾的结果,但可观察到循环NK细胞的整体减少和细胞溶解损伤。在AS中,描述了NK细胞的功能被同样地受损[ 45 ],但,在与其他自身免疫疾病中,增加的NK细胞数报道[ 46,47 ]。如果将非应答者组与正常供者进行比较,我们可以证实这一观察结果(图  3a); 然而,应答者群组中的NK细胞频率与健康个体的数量相似。由于疾病依赖性升高的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)识别HLA-B27抗原的能力强调了NK细胞与AS的病因之间的强烈关联,HLA-B27抗原在80-90%的AS患者中表达。 [ 48,49 ]。伴随着AS 中KIR3DL1 + NK细胞的发病上调频率,干扰素(IFN)γ的产生相应减少[ 50 ]。此外,活化的KIR3DL2 + NK细胞在SpA中增加并且可能发挥致病作用。

对NK细胞区室的深入分析显示,表达CD8抗原的经典NK细胞的频率显示出与抗TNF反应性的显着和正相关。已知的是,而CD8阳性子集被描述为显示出增强的细胞毒性功能,NK细胞的约40%的可变表达CD8在α/α的同型二聚体形式与其CD8阴性配对[比较51,52 ]。对于健康对照组或AS患者组中CD8阳性NK细胞的频率,我们无法检测到显着的年龄或性别相关差异。因此,我们的数据暗示表达CD8αα同型二聚体的NK细胞直接或间接参与抗TNF-α阻断剂所发挥的免疫抑制作用。

如果直接参与表达CD8αα的NK细胞,可以认为它们增加的细胞毒活性和/或它们对细胞毒性诱导的细胞凋亡的减少的行为是TNF阻断剂的改善的响应性的原因。或者,可以假设NK细胞上的CD8αα受体与HLA-I家族分子的结合可以引起促炎细胞因子TNF-α和IFNγ的分泌增加[ 53 ],这反过来促进TNF受体。 (TNFR)合成及其蛋白水解成可溶形式[ 54]。通过这种机制,内源性合成sTNFRs [ 55,56 ]可以协作地支持治疗TNF抑制剂[的动作57,58]。这些非信号“诱饵”受体仍然能够结合TNF,因此可以作为与ETN相当的天然TNF拮抗剂[ 59]]。由于我们在研究中纳入了阿达木单抗和依那西普治疗的患者,因此有必要知道,当TNF-α被ADA中和或被sTNFR2融合蛋白(ETN)清除时,是否可检测到反应性预测的差异。尽管组大小减少导致预测分析的统计效力较低,但与ADA治疗的患者相比,我们可以确定与ETN治疗的患者相关性更好。因此,这些研究结果对于在适当群体规模的新独立队列中进行验证是令人鼓舞的。如果该结果可以得到验证,则表明多种更复杂的作用方式超出了TNF-α阻断剂的中和作用。

为了阐明从健康个体分离的CD8阳性和CD8阴性NK细胞亚群中TNFR表达的可能差异,我们进行了全基因表达分析,但未检测到TNFR1,TNFR2或TNF-α的任何差异表达(数据未显示) )。比较健康个体中TNFR1和TNFR2的表达,显然TNFR2可检测到更高的表达水平(数据未显示)。不幸的是,到目前为止,我们没有机会分析从AS患者中分离的细胞,以测试TNFR或TNF-α是否在慢性炎症条件下差异表达。因此,根据我们的数据,可以推测CD8阳性NK细胞显然能够扩增TNF阻断剂的中和作用,

结论

尽管我们的研究结果很有希望,但在AS和其他成功施用抗TNF阻断剂的风湿性和胃肠道疾病的独立队列中,CD8阳性NK细胞作为TNF反应性的潜在生物标志物的进一步验证是必要的。然而,我们的研究首次证明了通过广泛的免疫表型分析方法可以在外周血中鉴定细胞反应特征的概念。即使CD8阳性NK细胞的确切机制和TNF-α阻断剂的治疗效果在AS中是相互关联的,但到目前为止还很难理解,通过流式细胞仪监测这些细胞提供了一个有趣的新诊断选择,以应对个体化治疗概念,至少在慢性炎症性风湿性疾病领域。

缩略语

ADA: 阿达木单抗

 如: 强直性脊柱炎

 BASDAI: 巴斯强直性脊柱炎疾病活动指数

CRP: C-反应蛋白

 ERAP: 内质网氨肽酶

 ESR: 红细胞沉降率

 ETN: 依那西普

慧聪网: 健康的控制

 IBD: 炎症性肠病

 贾: 青少年炎症性关节炎

KIR: 杀伤细胞免疫球蛋白样受体

 MFI: 平均荧光强度

 MMP: 基质金属蛋白酶

NK: 自然杀手

 NR: 无应答

 NSAID: 非甾体类抗炎药

 PSO: 银屑病

R: 急救员

 RA: 类风湿关节炎

 SAA: 血清淀粉样蛋白A.

 SNP: 单核苷酸多态性

温泉: 脊柱关节炎

 STNFR: 可溶性人肿瘤坏死因子受体

 TNF: 肿瘤坏死因子

VEGF: 血管内皮生长因子

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