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BATF通过调节T辅助细胞分化来调节胶原诱导的关节炎

国际前沿|来源:BMC |作者:Sang-Heon Park 评论(0)
Sang-Heon Park ,Jinseol Rhee ,Seul-Ki Kim,Jung-Ah Kang,Ji-Sun Kwak,Young-Ok Son,Wan-Su Choi,Sung-Gyoo Park和张洙淳
抽象
背景
我们最近证明BATF是激活蛋白-1(AP-1)家族的成员,它调节骨关节炎软骨的破坏。在这里,我们探讨了BATF在小鼠胶原诱导的关节炎(CIA)中的作用和调节机制。

方法
CIA和K / BxN血清转移用于在野生型(WT)和Batf - / -小鼠中产生炎性关节炎模型。通过检查CIA发病率,临床评分,滑膜炎,滑膜增生,发炎滑膜中的血管生成,血管formation形成,骨侵蚀和软骨破坏来确定RA表现。通过检查免疫细胞群和细胞因子产生来分析RA中的免疫特征。

结果
BATF在关节滑膜组织中上调,其中炎症性关节炎是由CIA或K / BxN血清转移引起的。CIA诱导的WT小鼠中CIA发病率,临床评分和自身抗体产生的增加在相应的Batf - / - DBA / 1 J小鼠中被完全消除。Batf的基因消融还抑制CIA诱导的滑膜炎,滑膜增生,滑膜组织中的血管生成,血管formation形成,骨侵蚀和软骨破坏。Batf敲除抑制T辅助(Th)17细胞的分化和CD4 + Foxp3 +细胞向CD4 + IL-17 +的转化细胞。然而,BATF不调节成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)的功能,包括趋化因子,基质降解酶,血管内皮生长因子和NF-κB配体受体激活剂(RANKL)的表达。

结论
我们的研究结果表明,BATF通过调节Th细胞分化而不直接影响FLS的功能来关键地介导CIA。

关键词
BATF(基本亮氨酸拉链转录因子
ATF-等)
Th细胞
胶原蛋白诱导的关节炎
成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)
软骨

背景
BATF(碱性亮氨酸拉链转录因子,ATF-等)是激活蛋白-1(AP-1)家族,其成员调节各种生物功能[成员1 - 3 ]。BATF,它缺乏一个反式激活域,与JUN异源二聚体结合的AP-1位点的转录调控[ 3,4 ]。我们最近证明了BATF通过调节软骨细胞中的合成代谢和分解代谢基因表达来调节小鼠的骨关节炎(OA)[ 4 ]。我们发现BATF的过表达上调了基质降解酶和下调的软骨基质分子; 我们还发现,BATF在小鼠关节组织中的表达促进了OA软骨的破坏,相反地,敲除了Batf在小鼠(Batf - / -)中抑制实验OA [ 4 ]。

OA和类风湿性关节炎(RA)是最常见的关节炎类型,具有某些表型特征,如软骨破坏[ 5 ]。然而,这些疾病的病因,致病机制和与每种发病机制相关的细胞类型明显不同。OA是一种退行性关节疾病,与表面的破坏开始关节软骨[ 6,7 ]。朝向OA易患机械应力(即,关节不稳定)和因素(即,老化)是OA发病[的重要原因6,7]。相反,RA是一种炎症性自身免疫疾病,主要针对滑膜,导致关节结构的破坏。各种细胞类型的关节组织的与RA发病相关的,包括T细胞,B细胞,巨噬细胞,滑膜细胞,软骨细胞,破骨细胞和[ 8 - 10 ]。T细胞介导的自身免疫反应中起在RA发病机制中的关键作用,其中白细胞介素(IL)-17的T辅助(Th)细胞作为效应至关重要[ 8,11,12]。[RA的特征在于滑膜炎与免疫细胞的浸润,滑膜增生经由滑膜细胞,如巨噬细胞样滑膜细胞(MLS)和成纤维细胞样滑膜细胞(FLS),和血管生成中的增生性滑膜的增殖产生8 - 10 ] 。滑膜细胞表达许多细胞因子,这些细胞因子与RA中涉及的许多免疫过程有关[ 13 ]。RA表现还包括由血管形成引起的骨和软骨的侵蚀,血管pan是增生性滑膜的侵略性前沿。血管翳侵入,并通过破骨细胞[的作用破坏矿化软骨和骨8 - 10 ]。

已知BATF可以调节OA软骨破坏,我们之前已经证明BATF在关节组织中的过度表达导致滑膜炎症[ 4 ],表明BATF可能导致炎症性关节炎。这个概念是由报告说促炎细胞因子,如IL-1β和IL-6,增加BATF表达在幼稚CD4支持+ T细胞[ 14,15 ],BATF直接调节IL-17的表达,和BATF缺陷型小鼠显示电阻实验性自身免疫性脑脊髓炎[ 16 ]。BATF还控制B细胞中滤泡Th细胞(Tfh)和类别转换重组的发展[ 17]。此外,抑制c-Fos / AP-1的转录活性可抑制小鼠RA模型中的关节炎关节破坏[ 18 ]。然而,虽然这些先前的报道表明BATF可能参与RA发病机制,但BATF的作用及其调节机制尚未得到很好的理解。

在这项研究中,我们检查了BATF是否是胶原诱导的关节炎(CIA)所必需的,这是一种常见的炎症性关节炎实验模型,由T细胞依赖性,抗体介导的针对软骨II型胶原的自身免疫反应引起[ 19] ]。在这里,我们显示Batf在小鼠中的基因消融抑制了CIA的表现,包括滑膜炎,滑膜增生,发炎滑膜中的血管生成和关节组织中的软骨/骨侵蚀。我们还揭示了BATF通过调节Th细胞分化来调节CIA而不直接影响FLS的功能。

方法
小鼠和实验性RA
雄性野生型(WT)和Batf - / - DBA / 1 J小鼠用于产生CIA模型。将C57BL / 6-背景Batf - / -小鼠[ 4 ]与DBA / 1J小鼠回交以产生Batf - / - DBA / 1J小鼠。所有小鼠均按照光州科学技术研究所动物护理和伦理委员会批准的方案使用。CIA诱导的标准协议[ 19,20]。小鼠皮内注射单独的不完全弗氏佐剂(未免疫的; NI)或含有100μgII型胶原(CIA)的弗氏佐剂。21天后给予加强注射。在第一次免疫后的指定天数评估关节炎的发病率和严重程度。使用爪的临床评分(0-4级)肿胀[严重性进行评价19,20 ]。固定关节组织,用0.5M EDTA脱钙,包埋在石蜡中,并以5-μm厚度切片。滑膜炎用苏木精和伊红(H&E)染色,和滑液炎症(0-4级)评估如先前所述[进行评分19,20 ]。通过H&E染色观察血管pan并通过评分(0-4级)量化[19, 20 ]。软骨破坏物通过番红O染色检查,并使用OARSI(骨关节炎研究学会国际)分级系统[得分 4, 20 ]。在WT和 Batf - / - C57BL / 6小鼠中,K / BxN血清转移也诱导炎性关节炎[ 21 ]。通过将KRN T细胞受体(TCR) - 转基因(K / B)小鼠与非肥胖糖尿病(NOD)小鼠杂交产生关节炎转基因小鼠(K / BxN)和非转基因同窝小鼠(BxN)。分别从K / BxN和BxN小鼠收集K / BxN和对照血清,并在第0天和第2天腹膜内给予受体小鼠。在血清转移后第14天处死小鼠。

免疫组织化学,免疫荧光显微镜和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色
通过将关节切片在60℃下与柠檬酸钠缓冲液(10mM柠檬酸钠,0.05%Tween 20,pH 6.0)一起孵育过夜来回收抗原。切片用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的2%牛血清白蛋白封闭,然后与一抗孵育,包括兔抗BATF(Brookwood Biomedical),兔抗RANKL(NF-κB配体的受体激活剂)( Abcam),山羊抗IL-6(R&D Systems),兔抗TNF-α(肿瘤坏死因子α)(Novus Biologicals)和兔抗Ki67(Abcam)。Dako REAL Envision Detection系统用于显色显色。通过波形蛋白对FLS的双重免疫荧光标记,巨噬细胞的CD11b,T细胞的CD4和B细胞的B220来鉴定滑膜组织中表达BATF的细胞。使用以下一抗:小鼠抗CD4,小鼠抗-B220,大鼠抗-CD11b(Abcam),兔抗-BATF(ThermoFisher Scientific)和小鼠抗波形蛋白(BD Pharmingen)。用小鼠抗CD31(Dianova)检测滑膜组织中的血管。如前所述,TRAP活动在联合部分确定[20, 22 ],和TRAP阳性破骨细胞的数目在含有血管翳-软骨和血管翳骨界面区域进行计数。

FLS培养和增殖试验
从WT或Batf敲除(KO)小鼠中分离FLS,并如Zhao等人所述进行培养。[ 23 ]。第4-8代的FLS用于进一步分析。使用针对CD90和CD14(Abcam)的抗体通过流式细胞术鉴定纯FLS(> 90%CD90 + / <1%CD14 +)。通过测量溴脱氧尿苷(BrdU)掺入来量化培养物中的FLS增殖[ 20]。简而言之,用或不用肿瘤坏死因子(TNF)-α(100ng / ml)处理在96孔板中培养的FLS,并使用细胞增殖酶联免疫吸附测定(ELISA)BrdU试剂盒检测BrdU标记(罗氏公司)。通过使用获自Abcam的抗体检测Ki67来鉴定滑膜切片中的增殖细胞。空腺病毒(Ad-C)和表达BATF的腺病毒(Ad- Batf)如前所述[ 4 ]。用指定的感染复数(MOI)将Ad- Batf和Ad-C 感染FLS 2小时,洗涤,并在分析前维持48小时。

自身抗体产生的ELISA
通过ELISA测量II型胶原蛋白特异性抗体[ 20 ]。将来自NI和CIA小鼠的血清加载到II型胶原包被的96孔板中,在4℃温育过夜,洗涤,并用碱性磷酸酶标记的针对小鼠IgG1,IgG2a或IgG2b的单克隆抗体孵育1小时(免疫学)顾问实验室)。使用对硝基苯基磷酸酯作为显色反应的底物,并使用ELISA板读数器定量所得的显色反应。

RT-PCR,qRT-PCR和Western印迹
使用TRI试剂从培养的FLS中分离总RNA。将分离的RNA逆转录,并将得到的cDNA用于RT-PCR。PCR引物和实验条件如前所述,用于BATF,基质金属蛋白酶(MMP)3和MMP13 [ 4 ],以及CCL2,CCL5,CXCL1,CXCL5,CXCL10,GAPDH,RANKL和血管内皮生长因子(VEGF)。 )[ 20 ]。对于Western印迹,将FLS细胞在冰上孵育30分钟,用放射免疫沉淀测定缓冲液(10mM磷酸钠,pH7.2,150mM NaCl,1%SDS,1%脱氧胆酸盐,1%Nonidet P-40)。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分级分离全细胞裂解物,并使用兔抗BATF(Brookwood Biomedical)和山羊抗Lamin B(Santa Cruz)进行免疫印迹。

流式细胞术分析
如前所述,从6周龄至8周龄的WT和Batf - / -小鼠中分离胸腺细胞,脾细胞和淋巴细胞[ 20 ]。用于检测细胞表面抗原,细胞(1×10 6用荧光染料偶联的一抗标记。为了检测细胞内抗原,将表面染色的细胞固定并用透化缓冲液(eBioscience)或Foxp3 /转录因子染色缓冲液(eBioscience)透化。以下抗体购自eBioscience进行细胞染色:AlexaFluor488®-缀合的抗小鼠CD4和抗小鼠/大鼠Foxp3; FITC缀合的抗小鼠TCRβ和抗小鼠CD8; PerCP Cy5.5-缀合的抗小鼠CD25,抗小鼠CD62L和抗小鼠干扰素(IFN)-γ; APC缀合的抗小鼠CD4,抗小鼠B220和抗小鼠IL-17A; PE缀合的抗人/小鼠CD44,抗小鼠IL-4,抗小鼠CD25和抗小鼠/大鼠Foxp3; 和eFluor450®-缀合的抗小鼠CD4和PE- Cyanine7-缀合的抗小鼠CD4。

体外分化Th细胞
CD4 + T细胞是从WT和脾中分离BATF - / -使用EasySep™小鼠CD4小鼠+ T细胞分离试剂盒(干细胞)。在Th细胞分化条件下培养细胞(2.5×10 5)120小时[ 23 ]。简而言之,为了将CD4 + T细胞体外分化为Th1细胞,用抗小鼠CD3(5μg/ ml),抗小鼠CD28(5μg/ ml),IL-12(20ng / 20)培养分离的细胞。 ml),IL-2(20ng / ml)和抗IL-4(10μg/ ml)。用于CD4 +的体外分化将T细胞转入Th2细胞,分离细胞与抗小鼠CD3(5μg/ ml),抗小鼠CD28(5μg/ ml),IL-4(25ng / ml),IL-2(20ng / ml),抗IFN-γ(10μg/ ml)和抗IL-12R(10μg/ ml)。为了将CD4 + T细胞体外分化为Th17细胞,将分离的细胞与抗小鼠CD3(5μg/ ml),抗小鼠CD28(5μg/ ml),IL-6(100ng / ml)一起培养。 ,小鼠转化生长因子(TGF)-β(5ng / ml),抗-IFN-γ(10μg/ ml)和抗-IL-4(10μg/ ml)。用于CD4 +的体外分化将T细胞转入Treg细胞,分离细胞与抗小鼠CD3(5μg/ ml),抗小鼠CD28(5μg/ ml),小鼠TGF-β(5ng / ml)和IL-2( 20 ng / ml)。在Th细胞分化后,用佛波醇-12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA; 50ng / ml),离子霉素(500ng / ml)和布雷菲德菌素A溶液(eBioscience)活化后,通过流式细胞术分析分析细胞因子产生。额外4小时。为了在体外测试Treg细胞对Th17细胞的可塑性,将分离的细胞与抗小鼠CD3(5μg/ ml),抗小鼠CD28(5μg/ ml),小鼠-TGF-β(5ng / ml)一起培养。 )和IL-2(20ng / ml),持续2天。然后,洗涤细胞并进一步与抗小鼠CD3(5μg/ ml),抗小鼠CD28(5μg/ ml),IL-6(100ng / ml),小鼠-TGF-β(5ng)一起孵育。 / ml),抗-IFN-γ(10μg/ ml)和抗-IL-4(10μg/ ml),持续3天。

细胞因子分析
为了测量分泌的细胞因子水平,从CIA小鼠的淋巴结中分离淋巴细胞。用PMA(50ng / ml)和离子霉素(500ng / ml)培养分离的淋巴细胞(1×10 6)4小时[ 24 ]。使用LEGEND MAX小鼠IL-6ELISA试剂盒和小鼠IL-13 Platinum ELISA试剂盒(Invitrogen)分别检测IL-6和IL-10。BD细胞计数珠阵列解决方案(BD Biosciences)和FACS Canto II流式细胞仪(BD Biosciences)用于测量分泌的细胞因子,例如IL-2,IL-4,IL-10,IL-17A,IFN-γ和TNF-α。

统计分析
非参数Mann-Whitney U检验用于基于序数分级系统的数据分析,例如滑膜炎,血管pan和OARSI等级。对于从ELISA获得的结果和关节厚度,TRAP阳性细胞和BrdU掺入的分析,首先使用Shapiro-Wilk测试测试数据与正态分布的构象。通过Student's t检验(成对比较)或方差分析(ANOVA)与适当的事后检验(多重比较)分析数据。0.05的概率接受显着性(P  <0.05)。

结果
BATF在关节炎关节的滑膜组织中上调
为了探讨BATF在炎性关节炎中的可能功能,我们首先检查了用CIA处理的DBA / 1J小鼠的关节炎关节中BATF的表达模式。免疫染色显示,在CIA的发炎滑膜组织中BATF表达显着增加(图  1a)。相反,在接受CIA条件的Batf - / -小鼠的滑膜组织中未检测到BATF(即,没有明显的滑膜炎或滑膜增生)(图1a)。正如所料,CIA滑膜组织中TNF-α和IL-6也显着增加(图1b)。为了鉴定滑膜组织中表达BATF的细胞类型,我们用各种滑膜细胞类型的标记进行了BATF的双重免疫荧光染色,包括FLS的波形蛋白,T细胞的CD4,B细胞的B220和巨噬细胞的CD11b。在CD4 + T细胞(> 80%),CD11b +巨噬细胞(~40%)和表达波形蛋白的FLS(<50%)的子集中检测到BATF ,但在表达B220的B细胞中未检测到(图1c)。
图。1

Batf的基因消融抑制CIA
我们接下来检查了BATF是否规范了CIA。在WT小鼠中观察到的CIA表现,包括CIA发病率,临床评分和爪肿胀,在Batf - / - DBA / 1 J littermate中被完全消除(图  2a,b)。针对II型胶原的IgG自身抗体的产生是RA发病机理中的关键病理学变化,并且IgG2a自身抗体在CIA模型中尤其占优势[ 25 ]。与上述结果一致,在CIA诱导的WT小鼠的血清中IgG2a产生显着增加,但这在Batf - / -同窝仔畜中被完全抑制(图2c)。这些结果共同表明BATF是DBA / 1J小鼠中CIA发病机理所必需的。
图2

Batf的基因消融抑制滑膜组织中CIA诱导的滑膜炎,滑膜增生和血管生成
CIA的特征在于,通过滑膜细胞的增殖产生了一个滑膜增生,滑膜炎与免疫细胞浸润和血管生成中滑膜组织[ 8 - 11 ]。在这里,我们发现CIA诱导的滑膜炎在Batf - / -小鼠中被显着阻断,如通过H&E染色和炎症评分所确定的(图  3a,b)。为了检查滑膜增生,我们通过Ki67染色确定了滑膜细胞增殖[ 26 ]。Ki67在经受CIA诱导条件的WT小鼠的滑膜组织中高度表达,而在相应的Batf - / -小鼠中完全不存在(图3c)。)。通过使用从WT和Batf - / -小鼠获得的解离的FLS进行的BrdU掺入测定进一步证实了Batf - / -小鼠中滑膜细胞增殖的抑制。与WT FLS相比,Batf缺陷型 FLS对TNF-α的应答显示出显着较低的增殖(图3d)。
图3

炎性滑膜组织表达VEGF,其刺激血管生成以维持慢性炎症状态[ 27 ]。与上述结果一致,在CIA诱导的WT小鼠中观察到新血管形成(通过CD31染色确定),但在Batf - / -小鼠中未观察到(图3e)。以前的研究表明,FLS通过产生一个具有血管形成有关[血管生成因子有助于CIA 10,20,27,28 ],而我们的研究组报道,缺氧诱导因子(HIF)-2α,其通过调节FLS功能导致RA发病,刺激FLS中的VEGF表达[ 20]。在这里,我们发现FLS中BATF的过表达不会引起VEGF的可检测表达(图3f)。此外,尽管BATF在表达波形蛋白的CIA滑膜FLS中上调(图1c),但用IL-6或TNF-α处理FLS,即严重调节RA发病机制的细胞因子[ 13 ],并未诱导BATF表达(图1c)。3f)。此外,TNF-α或IL-6诱导的FLS中基质降解酶(MMP3和MMP13),趋化因子(CCL2和CCL5)和趋化因子受体(CXCL1,CXCL5和CXCL10)的上调不受Batf KO的影响。(图3g)。

Batf的基因消融抑制CIA诱导的骨和软骨侵蚀
由于CIA涉及血管翳的形成,其侵入和破坏矿化软骨和骨[ 8 - 11 ],我们接着检查BATF的血管翳形成和随后的骨和软骨破坏的可能作用。实际上,我们发现在WT小鼠中发现的CIA诱导的血管formation形成在Batf - / -小鼠中被完全消除(图  4a)。接着,我们检查了RANKL的表达,从而促进破骨细胞分化刺激骨侵蚀[ 29,30 ]。WT小鼠中CIA的诱导增加了RANKL在骨/血管pan界面的表达,但这在Batf - / -同窝仔中完全消失(图4b))。尽管已知FLS产生RANKL [ 20 ],但FLS中的BATF过表达并未触发RANKL的任何上调(图3f),表明CIA滑膜FLS中BATF的上调与RANKL表达没有直接关联。此外,在Batf - / -同窝仔畜中未观察到在WT小鼠的骨/血管协调器界面处高度增加的TRAP阳性破骨细胞(图4c)。这些结果共同表明Batf KO通过阻断RANKL表达和破骨细胞分化来抑制CIA诱导条件下的骨侵蚀。
图4

通过safranin-O染色和OARSI分级确定WT小鼠中的CIA引起软骨破坏(图4d)。与骨侵蚀的情况类似,在Batf - / -同窝仔畜中完全消除了软骨破坏(图4d)。CIA在软骨破坏可以通过血管翳,其侵入和破坏软骨矿化,或由滑膜细胞和软骨细胞[制备基质降解酶引起的31,32 ]。虽然在炎性关节组织中的基质降解酶主要是由滑膜细胞,如FLS [产生31,32],FLS中的BATF过表达不会导致测试的基质降解酶(MMP3和MMP13)或趋化因子和趋化因子受体(CCL2,CCL5,CXCL1,CXCL5和CXCL10)的任何上调(图3f)。然而值得注意的是,我们之前发现BATF过表达导致软骨细胞产生MMP3和MMP13 [ 4 ]。这些结果共同表明由软骨细胞而非FLS产生的基质降解酶可能在CIA期间促成软骨破坏。

Batf的基因消融不影响胸腺T细胞的发育
鉴于T细胞,如Th17细胞,在炎症性关节炎中起着至关重要的作用[ 33 ],我们检测了Batf缺乏是否影响DBA / 1 J小鼠的T细胞发育。流式细胞术分析显示胸腺T细胞发育不受DBA / 1J小鼠中Batf缺失的影响(图  5a)。然而,与先前的报道[ 34 ]一致,Batf - / -小鼠在外周器官中表现出改变的T细胞群,例如脾和淋巴结(图5b,c)。与WT小鼠相比,Batf的脾脏(图5b)和淋巴结(图5c)中的T细胞略微减少- / -老鼠。CD4 +效应/记忆T细胞在 Batf - / -小鼠的脾脏(图 5b)和淋巴结(图 5c)中也略微减少。总体而言,虽然 Batf缺失改变了外周T细胞亚群的数量,但改变程度很小(即小于10%)(图 5b,c)。
图5

Batf KO调节Th细胞分化
为了进一步阐明BATF的功能,我们检查了Batf缺乏是否影响CD4 + T细胞体外分化为Th细胞,包括Th1(CD4 + IFNγ +),Th2(CD4 + IL-4 +),Th17(CD4)+ IL-17A +)和Treg细胞(CD4 + Foxp3 +)。有趣的是,Batf缺失显着增加了Batf - / -小鼠的Th2细胞分化,而体外Th1和Treg细胞分化不受Batf基因缺失的影响(图  6a)。巴德富与WT对照小鼠相比,基因缺失还显着降低了Batf - / - DBA / 1J小鼠中Th17细胞的分化(图6a)。与该发现一致,在受到CIA诱导条件的Batf - / -小鼠的淋巴结中Th17细胞群显着减少(图6b)。此外,在CIA诱导的Batf - / -小鼠的外周淋巴结中CD4 + Foxp3 + IL-17 +细胞群显着减少(图6c)。据报道,Treg细胞向Th17细胞的转化可以加剧Th17介导的炎症[ 35],我们检查了BATF是否影响体外Treg细胞向Th17细胞的转化。实际上,BATF缺乏显着地消除了Treg细胞向Th17细胞的转化(图6d),表明BATF调节了这种转化。最后,我们分析了在CIA诱导条件下Batf - / -小鼠和WT同窝小鼠的淋巴结中细胞因子的产生。与Th2细胞分化的增加一致,与WT同窝小鼠相比,CIA诱导的Batf - / -小鼠中Th2细胞因子IL-4,IL-10和IL-13的产生增加(图6e)。另外,在CIA诱导的Batf - / -小鼠中IL-6也增加(图6e)。相反,在CIA诱导条件下,Batf - / -小鼠中炎性细胞因子IL-2,IL-17和TNF-α的产生减少(图6e)。
图6

Batf的基因消融不影响由K / BxN血清转移引起的炎性关节炎
最后,我们使用经K / BxN血清转移的C57BL / 6小鼠检查了BATF在T细胞非依赖性炎性关节炎中的可能作用[ 21 ]。免疫染色显示,由K / BxN血清转移引起的炎症滑膜组织中BATF表达显着增加(图  7a)。然而,在Batf KO小鼠中,由WT小鼠中的K / BxN血清转移引起的炎性关节炎的所有检查表现(即,爪厚度,滑膜炎症和软骨侵蚀)未显着抑制(图7b,c)。我们的研究结果表明,BATF对T细胞非依赖性炎症性关节炎不是必需的。
图7

讨论
我们在此表明,BATF是CIA所必需的,因为Batf - / -小鼠表现出完全抑制CIA的表现。我们进一步证明BATF在CIA期间调节Th细胞分化。RA的发病机理与IL-17的生产[的发炎的滑膜和增强的Th17细胞的富集相关联的8,9,36,37 ]。最近的一份报告表明,Treg细胞向Th17细胞的转化有助于CIA小鼠的骨质破坏[ 35 ],这表明这些细胞群之间的不平衡有助于CIA。已知BATF通过调节转录因子RORγt的表达调节Th17细胞分化[16 ],并控制T和B细胞中的类别转换重组[ 17 ]。因此,先前已知BATF在两种细胞类型中的多个层级起作用以全面调节转换抗体应答。在这里,我们证明BATF缺乏减少体内和体外Th17细胞分化。先前报道,一部分Foxp3阳性细胞也表达IL-17,并且在CIA小鼠中可以发现CD4 + Foxp3 + IL-17 +细胞[ 35 ]。然而,我们在这里发现 Batf缺乏症完全消除了CD4 + Foxp3 + IL-17 +在CIA诱导条件下产生细胞。我们目前研究的另一个有趣发现是BATF调节Th2细胞分化; 我们证明,与WT对照小鼠相比,在CIA诱导的Batf - / -小鼠中产生IL-4的CD4 + T细胞增加。这与先前的报告一致,即IL-4负面调节CIA的诱导和进展[ 38]。此外,在CIA滑膜组织的浸润B细胞中未检测到BATF。虽然这并不排除表达和BATF在外周淋巴组织B细胞中的可能作用,但我们的结果表明,浸润的B细胞中BATF的上调对于CIA的发病机制不是必需的。此外,我们发现由K / BxN血清转移引起的T细胞非依赖性炎性关节炎不受Batf - / -小鼠的影响。基于这些发现,我们提出BATF缺乏改变Th细胞分化,使Batf - / -小鼠抵抗CIA。因此,BATF抑制可能是治疗RA的有用策略。

我们还报道FLS与BATF介导的CIA调节没有直接关联,尽管BATF似乎调节FLS对TNF-α反应的增殖。越来越多的证据表明,FLS在RA发病的主要参与者[ 10,28 ]。FLS产生的细胞因子和趋化因子将T细胞吸引到RA滑膜,FLS与T细胞的相互作用导致两种细胞类型的激活。FLS也产生涉及软骨破坏,与新血管形成相关的血管生成因子基质降解酶,和RANKL [ 10,28 ]。后一因子调节破骨细胞生成,这需要前体细胞与表达RANKL的FLS或T细胞的物理接触[ 29,30, 39 ]。我们以前表明HIF-2α调节FLS的各种功能,包括增殖,RANKL和各种分解代谢因子的表达,以及破骨细胞形成潜能[ 20 ]。在这里,我们发现,与HIF-2α不同,TNF-α和IL-6不会在FLS中引起BATF表达,并且FLS中的BATF过表达不调节各种基质降解酶或趋化因子的表达。这些结果共同支持了我们的观点,即BATF调节CIA的能力不是由于直接BATF介导的FLS功能调节。

已经证明难以阐明软骨细胞在RA发病过程中软骨破坏中的作用[ 5 ]。这种破坏主要在血管翳和钙化软骨[的界面处发生5,40 ]。有证据表明蛋白多糖从表面区域丢失,软骨与滑液接触,但血管痉挛没有[ 5 ]。因为RA滑膜生产各种基质降解酶[ 5,8,9 ],在浅区软骨破坏,可能是由于滑膜细胞的功能。然而,蛋白多糖也可能从软骨的中部和深部区域丢失[ 5],提示软骨细胞可能通过释放基质降解酶帮助降解其自身的基质。实际上,我们最近证明了BATF上调软骨细胞中的MMP3和MMP13,导致OA发病过程中的软骨破坏[ 4 ]。因此,我们目前和之前的[ 4 ]结果表明,BATF介导的软骨细胞中MMP3和MMP13表达的调节与CIA期间的软骨破坏有关。

本研究的结果共同表明BATF调节小鼠的CIA,我们以前的工作表明BATF通过上调软骨细胞中的分解代谢酶(例如,MMP3和MMP13)而起到OA软骨破坏的分解代谢调节剂的作用[ 4 ]。因此,尽管它们的病因和发病机理不同,但RA和OA均受BATF调节。但是,涉及不同的机制; BATF通过上调软骨细胞中的基质降解酶来调节OA发病机制,而它似乎通过调节Th细胞分化来调节RA发病机制。因此,BATF可能是RA调节的有用目标。

结论
总之,我们在此证明BATF调节CIA,包括滑膜炎,滑膜增生,发炎滑膜中的血管生成,软骨破坏和关节组织中的骨侵蚀。我们还揭示了BATF通过调节Th细胞分化来调节CIA而不直接影响FLS的功能。

笔记
Sang-Heon Park和Jinseol Rhee对这项工作做出了同样的贡献。

缩略语
AP-1: 
活化蛋白-1

 BATF: 
基本的亮氨酸拉链转录因子,ATF样

BrdU的: 
溴脱氧尿苷

 中央情报局: 
胶原蛋白诱导的关节炎

ELISA: 
酶联免疫吸附测定

 FLS: 
成纤维细胞样滑膜细胞

 他: 
苏木精和伊红

HIF: 
缺氧诱导因子

 IFN: 
干扰素

 IL: 
白细胞介素

 KO: 
击倒

MLS: 
巨噬细胞样滑膜细胞

 MMP: 
基质金属蛋白酶

 你: 
未经免疫

OA: 
骨性关节炎

 PMA: 
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯

 RA: 
类风湿关节炎

RANKL: 
NF-κB配体的受体激活剂

 TCR: 
T细胞受体

 TGF: 
转变生长因子

日: 
T帮手

 TNF: 
肿瘤坏死因子

 陷阱: 
抗Tartase酸性磷酸酶

VEGF: 
血管内皮生长因子

 WT: 
野生型

参考
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