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靶向CCR5和μ阿片受体的二价化合物治疗小鼠炎性关节炎疼痛而不诱导药物耐受

国际前沿|来源:BMC|作者:Raini Dutta 评论(0)
Raini Dutta †,Mary M. Lunzer †,Jennifer L. Auger †,EyupAkgün,Philip S. Portoghese和Bryce A. Binstadt
关节炎研究与治疗 2018 20:154
https://doi.org/10.1186/s13075-018-1661-5©The Author(s)。2018

抽象
背景
疼痛伴随类风湿性关节炎和其他慢性炎症,并且难以控制。虽然阿片类药物提供有效的镇痛作用,但慢性阿片类药物的使用会导致耐受性和成瘾性。最近的研究已经证明了趋化因子和阿片受体信号传导途径之间的功能相互作用。报道的趋化因子和阿片受体的异二聚化导致我们小组开发出结合两种类型受体的二价化合物,其目标是将阿片类药物靶向炎症部位。MCC22是一种新的二价化合物,含有CCR5拮抗剂和通过22-原子间隔基连接的μ阿片受体(MOR)激动剂药效团。我们评估了MCC22在自发性炎性关节炎的K / B.g7T细胞受体转基因小鼠模型中的功效。

方法
将MCC22或吗啡以不同剂量腹膜内给予关节炎K / B.g7小鼠或非关节炎对照小鼠。使用电子von Frey试验,在药物施用之前和之后每天测量机械性疼痛超敏反应。计算MCC22相对于吗啡的效力。疼痛的功能读数包括握力和嵌套行为。使用单独的给药方案来确定药物是否诱导药理学耐受性。

结果
在该模型中,MCC22提供比吗啡强约3000倍的镇痛效果。MCC22的每日治疗也导致累积的镇痛作用,降低每日基线疼痛水平。MCC22在非关节炎对照小鼠中未产生可观察到的镇痛作用。重要的是,重复给予MCC22不会诱导药理学耐受,而类似的吗啡方案也是如此。用MCC22处理的关节炎小鼠的握力和嵌套行为均得到改善。MCC22不影响踝关节厚度和关节炎评分。MCC22的镇痛作用在遗传缺乏CCR5的K / B.g7小鼠中被消除,证明了拮抗剂药效团的受体特异性。

结论
MCC22是靶向CCR5和MOR的新型二价配体。我们的研究结果表明MCC22在炎症性关节炎模型中提供高效镇痛和改善的功能结果,而不会诱导典型的阿片类药物耐受。这些发现表明MCC22或类似化合物可用于治疗与炎性关节炎和相关病症相关的疼痛,同时最小化通常与慢性阿片类药物使用相关的风险。

关键词
镇痛
CCR5
趋化因子受体
异聚

阿片受体
疼痛

类风湿关节炎

背景
疼痛几乎影响所有慢性炎症患者,包括类风湿性关节炎(RA)。RA的疼痛是由于关节水平的局部因素以及中枢神经元处理。疼痛和炎症在许多层面上从分子到心理相互作用,使得慢性炎症的疼痛难以控制[ 1 ]。

阿片类药物是有效的镇痛药。然而,它们对慢性疼痛的使用是有限的,因为它们引起药理学耐受性,这意味着需要更高的剂量来实现有效的镇痛。这些较高的剂量导致过量服用和依赖/成瘾的问题[ 2 ]。阿片类药物及其受体与慢性炎症密切相关[ 3 ]。例如,从慢性炎性细胞释放的内源性阿片类药物可通过作用于阿片受体而提供局部疼痛缓解,阿片受体的敏感性因某些炎性化合物而增加。最近的研究表明,某些阿片受体可以与促炎症趋化因子受体形成异二聚体[ 4 ]。

许多趋化因子及其受体与白细胞浸润到RA患者发炎的滑膜有关[ 5 ]。CC趋化因子受体5型(CCR5)在T细胞和巨噬细胞中大量表达,其配体(CCL5)存在于RA患者的滑液中[ 5 ]。在青少年关节炎中,升高的CCL5滑膜水平预示着更严重的疾病过程[ 6 ]。这些观察结果表明CCR5可能在机制上参与炎性关节炎的发病机制。一些研究已经评估了CCR5拮抗剂在单独或与甲氨蝶呤组合的RA患者中的功效。然而,相对于安慰剂,这些化合物均未导致关节炎严重程度降低[ 7- 9 ]。

CCR5和μ阿片受体(MOR)均在某些神经元以及某些白细胞上表达[ 4 ]。CCR5可以与MOR异二聚化,这可以导致两种受体的功能脱敏[ 10 ]。具体而言,免疫细胞的阿片类药物治疗抑制了几种趋化因子诱导的趋化反应; 相反,用一些趋化因子预处理会降低某些阿片类药物诱导的趋化性[ 10 ]。我们小组已经开发了一种新颖的二价药效,MCC22,包括由22个原子的间隔加入了MOR激动剂和CCR5拮抗剂(TAK-220)[ 11,12 ](附加文件  1:图S1)。该设计的目的是将阿片类激动剂靶向增加的CCR5表达的解剖部位,从而潜在地增加其治疗效力。实际上,在脂多糖(LPS)诱导的炎症模型中,MCC22比直接递送到中枢神经系统的单体成分混合物提供了3500倍的强效镇痛作用[ 11 ]。在同一模型中,不可逆的MOR拮抗剂β-funaltrexamine(beta-FNA)[ 13有效抑制MCC22的抗伤害感受功效,暗示MCC22的MOR激动剂药效团在MOR-CCR5异二聚体中通过MOR原体的抗伤害作用的重要性(Akgün等,制备中的原稿)。包含MOR激动剂和代谢型谷氨酸受体5(mGluR5)拮抗剂的相关二价配体MMG22也通过22个原子间隔物连接,在小鼠癌症模型中具有比其单体成分更高的效力,并且重要的是不诱导阿片类药物耐受[ 14 ]。这些二价药效团的22原子间隔长度似乎是关键的。更长或更短的间隔物导致镇痛效力低得多,表明受体异构体作为MCC22和MMG22二价配体的靶标[ 11,14 ]。

我们假设MCC22给药可在炎性关节炎的情况下提供有效的镇痛作用。我们在自发性炎性关节炎的K / B.g7 T细胞受体(TCR)转基因小鼠模型中测试了该假设。在这个模型中,小鼠出现对称性多关节炎,主要影响踝/腕等效和数字[ 15 ]。

方法
动物
C57BL / 6(B6)背景上的KRN TCR转基因小鼠和H-2 g7(B6.g7)同源的B6小鼠是来自Diane Mathis和Christophe Benoist(哈佛医学院,波士顿,马萨诸塞州和生物技术研究所)的礼物。 MoléculaireetCellulaire,法国斯特拉斯堡)。Ccr5缺陷型(B6.129P2- Ccr5tm1Kuz / J)[ 16 ]和野生型B6小鼠购自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME,USA)。根据需要将小鼠杂交以产生用于该研究的动物。

根据大学的机构动物护理和使用委员会批准的方案,将动物维持在明尼苏达大学(明尼苏达州明尼阿波利斯)的我们的无特定病原体的动物设施中。

小鼠基因分型
通过从小鼠耳孔组织提取的基因组DNA的聚合酶链反应(PCR)扩增来确定小鼠的基因型。

血清CCL5水平的测定
根据制造商的说明书(R&D Systems),使用市售的酶联免疫吸附测定法测量CCL5 / RANTES的血清浓度。

免疫组织化学染色
如先前所描述[组织切片制备的17,18]。简而言之,将10%缓冲的福尔马林固定和脱钙脚踝的石蜡切片脱石蜡,并置于95℃的酸性抗原修复溶液(R&D Systems)中10分钟。将切片在室温下冷却20分钟并在冷自来水下漂洗5分钟。将Bloxall(Vector Laboratories)应用于切片以阻断内源性过氧化物酶10分钟。用2%牛血清白蛋白(BSA)中的抗CD16 / 32(克隆70-0161-M001,Tonbo Biosciences)和抗CD64(克隆139,302,BioLegend)封闭Fc受体。将切片与抗CCR5-生物素(克隆107,003,BioLegend)或对照亚美尼亚仓鼠IgG-生物素在4℃以1:100稀释温育过夜。将切片与Vectastain ABC试剂(Vector Laboratories)孵育30分钟,然后用ImmPACT DAB过氧化物酶底物(Vector Laboratories)孵育10分钟。

化合物合成和给药
MCC22和MCC14如前所述合成[ 11 ]。吗啡购自Mallinckrodt Pharmaceuticals Company(Mallinckrodt Chemical,St.Louis,Missouri)。将所有化合物溶解在10%(wt / vol)二甲基亚砜(DMSO)中,然后在最终溶液中稀释至小于1%DMSO。载体对照为1%DMSO。所有化合物均通过腹膜内注射给药。

机械超敏试验
通过使用电子Von Frey麻醉仪(IITC Life Science,Woodland Hills,CA)测量后爪退缩响应来量化机械疼痛阈值。简而言之,将动物置于具有金属网底的测试室中的外壳中,通过该金属网底施加von Frey刚性尖端单丝,并测量机械疼痛阈值(以克为单位)。每只动物的两只后爪的机械阈值(以克为单位)取平均值。在每剂药物或媒介物之前记录基线测量值。在给药后2小时再次测试动物的后爪缩回。药物每天给药一次,连续15天。在每个图中指示的日期记录。最多15天后,

公差测试
通过给予ED 90剂量(定义为90%动物经历镇痛作用的剂量)药物每天两次持续9天进行药物耐受性试验。在第1,3和9天进行电子Von Frey刺激,并记录机械阈值。

握力测量
根据制造商的说明,使用Chatillon Force Gauge DFE II(Ametek)记录前肢握力。

筑巢行为
如前所述[ 19 ] 进行了小鼠筑巢的评分。简而言之,巢穴分数(1-5级)是由笼子里的小鼠围绕它们使用相同数量的筑巢材料制成的巢穴/穹顶的壁高确定的(1 =在笼子中散布的筑巢材料,2 =扁平巢穴,3 =嵌套圆顶高度的一半,4 =嵌套圆顶的半高,5 =嵌套圆顶的一半高度)。进行双盲评分以测量嵌套圆顶的高度。

关节炎评估
根据标准方案评估踝关节厚度和关节炎严重程度评分[ 15 ]。简而言之,通过使用具有扁平砧座的Kafer刻度盘厚度计(长岛指示器服务,Hauppauge,NY)测量横跨踝部来确定踝部厚度测量值。关节炎严重程度评分使用每只爪子0-3的等级确定,其中0为正常,3为最大关节炎严重程度; 给定鼠标的最大总分为12。

脚踝的组织病理学
用苏木精和曙红染色10%福尔马林固定和脱钙踝的石蜡切片。根据Caplazi和Diehl的评分系统,对于炎症,纤维组织增生和软骨损伤,切片从0到正常评分为5分[ 20 ]。

统计分析
Prism 5.01(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)用于数据的所有分析和图形表示。对于涉及多重比较的测试,使用单向或重复测量双向方差分析(ANOVA),然后酌情使用事后Tukey或Sidak的多重比较测试。对于两组的比较,适当地使用配对t检验或Mann-Whitney U检验。每个实验使用的特定统计测试在图例中表示。使用非线性回归方法用Prism计算具有95%置信区间(CI)的ED 50值。对于所有测试,P值<0.05被认为是显着的。

结果
在K / B.g7关节炎小鼠中CCR5 / CCL5表达增加
我们首先试图确定CCL5和CCR5是否在K / B.g7小鼠中过表达。相对于非关节炎对照动物,K / B.g7关节炎小鼠中CCR5配体CCL5(RANTES)的血清水平较高(图  1a)。免疫组织化学染色显示非关节炎对照动物的肌腱和血管附近有一些CCR5表达; 在关节炎动物中,表达CCR5的浸润细胞在发炎的踝关节周围和内部很容易识别,包括在软骨下骨中的细胞休息中(图  1b); 软骨损失和胫骨关节间隙缩小也很明显。
图。1

MCC22的效力比吗啡高3000倍,并且取决于22个原子的间隔物长度
我们接下来询问包含MOR激动剂和CCR5拮抗剂的二价药效团MCC22是否会在该模型中提供有效的镇痛作用。我们使用电子Von Frey测试评估了小鼠的机械疼痛阈值。我们首先确定了MCC22和常用的阿片受体激动剂吗啡的镇痛作用达到峰值的时间。MCC22在给药后2小时达到峰值镇痛作用,在给药后30分钟达到吗啡(图  2a); 因此,我们将这些峰值时间用于所有后续实验。我们接下来比较了MCC22对吗啡的效力。标准剂量反应实验显示MCC22在减轻关节炎K / B.g7小鼠机械性痛觉过敏方面的效力比吗啡高约3000倍(图  2b-d))。MCC22的22原子间隔长度是至关重要的 - 具有较短的14原子间隔区(MCC14)的类似化合物在以相似剂量给予时不提供镇痛(图  2b)。
图2

MCC22在慢性炎症的情况下产生累积镇痛
为了确定MCC22在慢性关节炎疼痛中的功效,我们使用6周龄的K / B.g7小鼠,其最大关节炎严重度评分为12.每天给予K / B.g7关节炎小鼠MCC22,导致更高的镇痛效力在相对于每日基线疼痛阈值的第1天和第3天(图  3a)。值得注意的是,MCC22治疗的关节炎小鼠的基线疼痛阈值从第1天到第10天稳定增加,分别在第3天,第7天和第10天的第1天阈值增加了110%,148%和173%(图。  图3a)。接受载体的关节炎小鼠的疼痛阈值没有变化(图  3b)。对照非关节炎小鼠具有比关节炎小鼠更高的基线疼痛阈值,并且MCC22没有进一步增加,即使MCC22的剂量比其ED 50大10 4倍(图  3c)。这些发现表明MCC22在慢性炎性关节炎的情况下提供有效的镇痛作用。即使在这种高剂量下,MCC22也不会影响关节炎的严重程度评分; 在整个实验期间,所有小鼠的最大关节炎评分均为12(图  3d)。此外,MCC22治疗不影响踝关节增厚程度(图  3d)或关节炎严重程度的组织病理学评分(图  3e和附加文件  1):图S2)。
图3

MCC22不会诱导阿片类药物耐受
吗啡和其他阿片类药物的临床应用的主要限制是它们诱导药理学耐受性。因此,我们使用吗啡作为比较物评估MCC22是否在该模型中诱导耐受性。以最大药理作用(MPE)剂量的70%给予的MCC22在给药9天后保持镇痛效力,而吗啡的效力早在给药的第3天就减少(图  4)。此外,长期施用吗啡不会增加基线疼痛阈值,而MCC22则会增加(图  2a和  4)。因此,MCC22基本上比吗啡更有效,并且也不会引起典型的阿片类药物耐受性。
图4

MCC22改善关节炎小鼠的功能
由于疼痛和关节活动受限,患有炎性关节炎的患者在日常生活活动中遇到困难。因此,我们询问MCC22是否改善了K / B.g7关节炎小鼠的功能测量。首先,我们评估了前肢握力。与对照非关节炎小鼠相比,所有K / B.g7小鼠具有较低的握力。用MCC22处理9天的K / B.g7小鼠的握力增强,但用吗啡处理的小鼠则没有(图  5a))。这种差异在实验的早期时间点不明显(数据未显示)。作为函数的第二个度量,我们评估了嵌套行为。当给予压制的嵌套材料时,健康小鼠通常会筑巢,并且可以使用标准评分量表来量化嵌套行为。实际上,我们发现对照非关节炎小鼠比关节炎K / B.g7小鼠构建更强壮的巢。MCC22处理K / B.g7小鼠使嵌套行为正常化,而吗啡没有效果(图  5b,c)。总之,MCC22改善了患有炎性关节炎的小鼠的功能测量。这些影响不是由于炎症减少,因为用MCC22治疗对关节炎的严重程度没有影响(参见图  3d,e)。此外,这些改进的功能测量与我们的观察一致,即MCC22即使在较高剂量下也不会诱导典型的阿片类药物副作用(例如,呼吸暂停,镇静)。

图5

MCC22的功效取决于CCR5
MCC22包含CCR5拮抗剂和MOR激动剂药效团。为了测试其结合特异性,我们评估了MCC22在遗传缺乏CCR5的K / B.g7小鼠中的镇痛效力。值得注意的是,CCR5缺陷型K / B.g7小鼠与野生型K / B.g7小鼠等同地产生关节炎(数据未显示)。在CCR5缺陷的K / B.g7小鼠中,MCC22没有提供镇痛作用,而吗啡的镇痛效力保持完整(图  6)。这些数据表明MCC22的强效镇痛作用需要CCR5。
图6

讨论
阿片类药物是炎症性关节炎和其他疾病的有效镇痛药。然而,慢性阿片类药物给药促进阿片受体和痛觉过敏的下调,导致功效降低。此外,由于其成瘾性和依赖性,近年来滥用处方阿片类药物的数量大幅增加。因此,迫切需要开发更安全的替代方案来治疗关节炎患者的疼痛。

趋化因子是已知的介导和调节疼痛途径[ 21,22 ]。阻断趋化因子介导的信号通路正在成为缓解慢性疼痛的新潜在疗法。据报道,许多趋化因子途径和炎症性关节炎严重程度(包括CCR5)之间存在很强的相关性[ 4 ]。与此一致,我们观察到K / B.g7关节炎小鼠的滑膜关节中CCR5表达增加,以及其配体CCL5 / RANTES的循环浓度升高。因此,我们推断MCC22中的CCR5拮抗剂部分可能特异性地将其引导至介导炎性疼痛的细胞。

我们已经证明,MCC22的效力比吗啡高约3000倍,特别适用于炎症,并且不会诱导典型的阿片类药物耐受。我们还观察到每日MCC22给药时基线疼痛阈值稳定增加,但吗啡没有。此外,我们证明了MCC22显着改善了关节炎小鼠的常规功能活动,具有改善的握力和改善的筑巢行为。总之,这些研究结果表明MCC22可能是慢性炎症性疼痛患者的有用镇痛药,不会诱导耐受性/依赖性。

重要的是,MCC22并未降低该模型中关节炎的严重程度。这与我们的发现一致,即CCR5缺陷的K / B.g7小鼠仍然发展出与对照K / B.g7小鼠相当的关节炎,并且之前报道CCR5缺乏不影响小鼠血清转移关节炎的严重程度[ 23 ]。这也是与RA患者CCR5拮抗剂(马拉韦罗,AZD5672和SCH351125),这都没有表现在疾病活动评分[改进的研究是一致的7 9,8,]。因此,该系统中MCC22的CCR5拮抗剂部分的主要益处是可能通过结合MOR-CCR5异二聚体来改善其MOR激动剂部分的镇痛效力。与此观点一致,我们已经证明MCC22的镇痛效力特别取决于将CCR5拮抗剂与MOR激动剂分开的22原子间隔区,表明MCC22以特定方向与MOR和CCR5异二聚体相互作用[ 11 ]。关于MCC22与MOR和CCR5的相互作用如何调节两种受体功能的其他研究对于理解其效力的基础是至关重要的。

MCC22的主要细胞靶标是否存在于伤害感受神经元,小胶质细胞或潜在的白细胞中的问题仍未解决。我们赞成MCC22作用于由于慢性炎症而发生CCR5上调的神经元的可能性。需要进一步研究来检验这一假设。如果神经元是MCC22的主要细胞靶标,那么确定它是否作用于外周或中枢神经元也将是有意义的。

除了MCC22之外,最近还描述了几种其他的二价镇痛化合物,包括MDAN-21(MOR激动剂:δ阿片受体拮抗剂)[ 24 ],一系列MOR激动剂:大麻素受体1(CB1)拮抗剂[ 25 ],以及MMG22(MOR:代谢型谷氨酸受体5(mGluR5)拮抗剂)[ 14 ]。这些二价化合物中的每一种在慢性疼痛的不同鼠模型中都显示出抗伤害感受活性。与MCC22类似,与经典阿片类药物相比,这些化合物也会引起较少或不具有耐受性或成瘾行为。

在最近一项关于注射完全弗氏佐剂诱导的关节炎小鼠的研究中,一种新的改良阿片类药物,NFEPP((±) - N(3-氟-1-苯乙基哌啶-4-基) - N-苯基丙酰胺),一种氟化物据报道,芬太尼类似物具有强效的镇痛作用[ 26]。我们观察到与MCC22相似的镇痛效力为~1000倍低剂量。与NFEPP相似,MCC22也未在非发炎动物中发挥作用。此外,NFEPP不会产生任何不良副作用,如寻求奖励的行为,运动障碍,镇静,呼吸抑制或便秘。MCC22同样在不同的小鼠疼痛模型(我们未发表的数据)中没有产生条件 - 地点偏好,一种寻求奖励的措施。因此,在关节炎的情况下,MCC22似乎具有与NFEPP类似的镇痛和低副作用特征,但具有更大的效力。

结论
总之,MCC22是二价CCR5拮抗剂和MOR激动剂化合物,其在具有炎性关节炎的小鼠中提供有效的镇痛作用而没有阿片样物质的典型有害副作用。正在进行的研究旨在了解其作用的细胞部位以及它与CCR5和MOR的相互作用如何产生如此显着的效力。

笔记
Raini Dutta,Mary M. Lunzer和Jennifer L. Auger对这项工作做出了同样的贡献。

缩略语
铁道部: 
Mu阿片受体

 NFEPP: 
(±) - N(3-氟-1-苯乙基哌啶-4-基) - N-苯基丙酰胺

RA: 
类风湿关节炎

 TCR: 
T细胞受体

声明
致谢
作者感谢Diane Mathis和Christophe Benoist提供老鼠。

附加文件

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