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Fcγ受体介导的S100A8 / A9产生的中性粒细胞的流入作为抗原诱导的关节炎期间骨侵蚀的诱导物

学术资讯|来源:BMC|作者:Irene Di Ceglie 评论(0)
Irene Di Ceglie,Giuliana Ascone,Niels A. J. Cremers,Annet W. Sloetjes,Birgitte Walgreen,托马斯沃格尔,约翰内斯罗斯,J. Sjef Verbeek,Fons A. J. van de Loo,Marije I. Koenders,Peter M. van der Kraan,Arjen B. Blom,Martijn H. J. van den Bosch andPeter L. E. M. van Lent

抽象
背景
破骨细胞介导的骨侵蚀是类风湿性关节炎(RA)的核心特征。存在于大部分患者中的免疫复合物与Fcγ受体(FcγR)结合,从而调节免疫细胞的活性。在这项研究中,我们研究了FcγRs,特别是FcγRIV在抗原诱导的关节炎(AIA)中的作用。

方法
在野生型(WT),FcγRI,II,III - / -和FcγRI,II,III,IV - / -小鼠的膝关节中诱导AIA 。使用组织学评估骨破坏,抗酒石酸酸性磷酸酶阳性(TRAP +)破骨细胞和炎症的数量; 使用免疫组织化学评估巨噬细胞标记物F4 / 80,中性粒细胞标记物NIMPR14和alarmin S100A8的表达。使用流式细胞术测定骨髓中破骨细胞前体的百分比。用TRAP染色评估体外破骨细胞生成,并使用实时PCR评估基因表达。

结果
与AIA期间的WT小鼠相比,FcγRI,II,III,IV - / -小鼠的骨侵蚀减少,而对于FcγRI,II,III,IV - / -小鼠,对甲基化牛血清白蛋白的体液和细胞免疫应答均未受损。。在FcγRI,II,III,IV - / -和WT小鼠之间,关节炎小鼠的骨髓中破骨细胞前体的百分比和它们在体外分化成破骨细胞的能力是相当的。与这些观察结果一致,在AIA期间骨表面上的TRAP +破骨细胞的数量在两组之间是相当的。炎症,一种强烈激活破骨细胞活性的过程,在FcγRI,II,III,IV中减少- / -小鼠,并且值得注意的是,关节中存在的嗜中性粒细胞数量减少。相反与FcγRI,II,III,IV - / -小鼠中,AIA诱导的FcγRI,II,III的膝关节- / -小鼠导致增加的骨侵蚀,炎症和嗜中性粒细胞的数目,表明FcγRIV至关重要的作用通过募集中性粒细胞的联合病理学。最后,在骨侵蚀和关节中存在的中性粒细胞数量之间以及骨侵蚀与S100A8阳性细胞数量之间存在显着相关性,其中S100A8是由中性粒细胞强烈产生的刺激破骨细胞再吸收活性的警报。

结论
FcγRs在AIA期间通过诱导炎症在骨侵蚀的发展中起关键作用。特别地,FcγRIV通过诱导产生S100A8 / A9的嗜中性粒细胞流入关节炎关节来介导AIA中的骨侵蚀。

关键词
实验性关节炎
骨质侵蚀
破骨细胞
免疫复合物
的FcγR
中性粒细胞
S100A8
背景
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性和系统性自身免疫性疾病,主要影响关节[ 1 ]。随着炎症,过度骨侵蚀是本病[中央标志之一2,3 ]。在广泛性骨质疏松症旁边,在发炎的滑膜和骨之间的界面处观察到严重的局灶性骨侵蚀。破骨细胞,其源自骨髓前体细胞分化的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB配体(RANKL)的受体激活剂的影响下,负责该有害过程[细胞4,5,6]。因此,更深入地了解炎症反应如何增加这种疾病的骨侵蚀可能有助于确定新的治疗目标。

大多数RA患者的血清和滑液中存在类风湿因子(RF)和抗凝蛋白抗体等自身抗体[ 1 ]。值得注意的是,在RA患者中自身抗体的存在早疾病发作和与疾病进展和严重程度相关[ 7,8,9 ]。免疫球蛋白G(IgG)抗体可与其同源抗原形成免疫复合物(IC),随后与Fcγ受体(FcγRs)结合,从而调节携带FcγR的免疫细胞的活性[ 10 ]。

在小鼠中,已鉴定出四种不同的FcγR,其中活化的FcγRI,FcγRIII和FcγRIV通过激活基序免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)刺激细胞,导致效应功能,例如吞噬作用,抗原呈递和细胞因子。分泌。与此相反,FcγRIIb的是一种抑制性受体,并且它的细胞内结构域包含抵消活化FcγR的[的信令的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)10,11,12 ]。在的FcγR的表达的改变已经在循环的单核细胞和RA患者的滑膜组织进行了描述,这表明其在RA [发病机制参与13,14,15,16,17,18 ]。此外,FcγRs的关键致病作用已在多种实验性关节炎模型中得到证实,如胶原诱导的关节炎(CIA),葡萄糖-6-磷酸异构酶诱导的关节炎,II型胶原抗体诱导的关节炎,K / B×N血清转移模型,IC关节炎和抗原诱导关节炎(AIA)模型。总体而言,尽管各种实验模型之间存在一些差异,但激活FcγR刺激先天免疫细胞,导致有害作用。相反,FcγRIIb的诱导负反馈中自身抗体的产生,从而保护了关节从疾病[的发展和进展19,20,21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ]。然而,各种FcγR的功能及其在骨侵蚀调节中的确切作用机制仍有待阐明。

在AIA实验性RA模型中,将甲基化牛血清白蛋白(mBSA)注射到先前免疫小鼠的膝关节中导致IC的强烈局部积累,其通过激活免疫系统导致两种骨的降解。和软骨。在先前使用该模型的研究中,我们使用针对各种(组合)FcγR的敲除小鼠品系确定了滑膜炎症和骨破坏之间的关系。我们发现FcγR介导的炎症与骨侵蚀之间存在联系[ 29 ]。尽管FcγRs在破骨细胞上表达并因此可能参与其分化和活化,但IC介导的炎症中的核心作用归因于在AIA期间FcγR介导的巨噬细胞活化[ 30]]。它们的IC介导的激活导致产生过多的介质,例如趋化因子,负责将嗜中性粒细胞募集到关节中。然而,哪种FcγR特别参与调节这种细胞流入以及哪种细胞在介导骨破坏方面占主导地位仍然是一个争论的问题。

中性粒细胞在关节炎发展中的重要性已经在K / B×N血清转移实验RA模型中显示,其中中性粒细胞的消耗导致完全保护免于疾病发展[ 31 ]。与该发现一致,嗜中性粒细胞的高数是存在于患者的关节的活动性RA [ 32,33 ]。中性粒细胞大量产生的两个因子是S100A8和S100A9,它们占所有细胞溶质蛋白的约40%[ 34 ]。S100A8 / A9是,在细胞应激,被释放到细胞外环境中,它们的功能的免疫系统[作为有效诱导小钙结合蛋白35,36]。S100A8 / A9的高水平存在于患者的滑液与RA [ 37,38 ]。此外,已经表明S100A8能够通过TLR4直接刺激破骨细胞活性,这表明IC激活的先天免疫可以通过其调节RA中的骨侵蚀[ 39 ]。

在目前的工作中,我们研究了FcγRs,特别是FcγRIV参与破骨细胞介导的骨吸收的调节。我们在缺乏所有四种FcγR(FcγRI,II,III,IV - / -小鼠)和其野生型(WT)对照的小鼠中诱导AIA 。通过比较FcγRI,II,III,IV - / -和FcγRI,II,III - / -小鼠中AIA的发展,研究了FcγRIV的作用。

方法
动物
C57BL / 6背景中的FcγRI,II,III,IV - / -小鼠由S.Verbeek博士(莱顿大学医学中心,莱顿,荷兰)开发(Dr.J.Sjef Verbeek个人通信,2016年1月)。对照C57BL / 6小鼠购自Janvier Labs(Le Genest Saint Isle,France)。如前所述产生FcγRI,II,III - / -小鼠及其对照[ 29 ]。将小鼠在标准条件下饲养在过滤顶笼中,并随意喂食标准饮食和食物和自来水。所有动物研究均根据荷兰法律进行,并经当地动物实验委员会批准(RU-DEC 2012-209)。

AIA的诱导
用在完全弗氏佐剂(CFA; Difco Laboratories,Detroit,MI,USA)中乳化的100μgmBSA(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)免疫小鼠。将热灭活的百日咳博德特氏菌作为另外的佐剂腹膜内给药。一周后,在颈部区域进行两次皮下注射,总共50μg的mBSA / CFA作为加强剂。免疫后3周,通过在6μl盐水中关节内注射60μgmBSA,在两个膝关节中诱导关节炎。

血清中的血清收集和抗体滴度测定
在AIA诱导后第7天和第21天,在MiniCollect管(Greiner Bio-One,Monroe,NC,USA)中从眶后丛抽取血液,随后通过离心获得血清。用酶联免疫吸附测定法测定血清中的抗mBSA特异性抗体(总IgG,IgG1,IgG2a,IgG2b)。将mBSA以100μg/ ml的浓度包被在平板(Nunc; Thermo Fisher Scientific,Rochester,NY,USA)上。通过血清的两倍连续稀释来评估抗体浓度,然后用过氧化物酶缀合的兔抗小鼠IgG(SouthernBiotech,Birmingham,AL,USA)检测结合的小鼠IgG。使用5-氨基水杨酸作为底物。在450nm处测量吸光度。在最大吸收的50%下测定抗体滴度。

淋巴细胞刺激试验
在AIA诱导后第21天从小鼠收集脾脏并通过细胞过滤器匀浆。红细胞用裂解缓冲液(155毫摩尔NH裂解4氯,12mM的KHCO 3,0.1mM的乙二胺四乙酸,pH 7.3)中。将细胞接种到烧瓶中,并在37℃下1小时后,收获非粘附细胞并接种到96孔板(1×10 5细胞/孔)中。加入mBSA,终浓度为50,25,12.5,6.25,3.12和1.56μg/ ml。伴刀豆球蛋白A和卵清蛋白分别用作阳性和阴性对照。将培养物维持4天。在培养的最后16小时加入[3H]胸苷,并确定其掺入作为T细胞增殖的量度。

组织学分析
分离全膝关节,在4%磷酸盐缓冲的福尔马林中固定,在5%甲酸中脱钙,包埋在石蜡中,并且制备关节的不同深度的7-μm冠状切片。切片用H&E染色用于组织学分析。炎症(浸润和渗出)以0(无炎症)至3(严重炎症)的等级任意评分。在13个明确界定的膝关节区域评估骨破坏(如附加文件1中的方案所示) a)评分范围从0(无侵蚀)到3(关节腔和骨髓之间的连接)。为了评估蛋白多糖(PG)消耗作为软骨破坏的量度,将关节切片用番红O和Fast Green染色。使用从0(不存在PG耗尽)到3(完全PG耗尽)的任意分数,在髌股和胫股区域评估PG耗尽作为存在的红色染色量。为了定量破骨细胞的数量,使用白细胞酸性磷酸酶试剂盒(Sigma-Aldrich)根据制造商的方案对全部膝关节切片的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)进行染色。TRAP +的数量计数沿着外部骨表面存在的细胞。对于关节周围骨的定量,使用Leica Application Suite软件(Leica Microsystems,Buffalo Grove,IL,USA)定量用番红O和Fast Green染色的关节切片的完整股骨和胫骨中的非软骨胶原组织的百分比(蓝色染色)。 。

免疫组化
为了使S100A8-,NIMPR14-和F4 / 80-表达细胞可视化,将膝关节切片与针对S100A8(在我们的设施中制造)的特异性一抗孵育,NIMPR14(由M. Strath博士,伦敦,英国友情提供)和F4 / 80(赛默飞世尔科技)。然后,将切片与辣根过氧化物酶缀合的或生物素化的二抗孵育,然后与抗生物素蛋白 - 生物素复合物过氧化物酶(VECTASTAIN Elite Kit; Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)一起孵育。使用二氨基联苯胺显现抗体结合。使用0至3的等级任意评分S100A8染色。对于NIMPR14和F4 / 80阳性细胞的定量,拍摄关节的五个特定区域的图片(原始放大倍数×100)(两个在髌骨附近区域,两个在内侧和外侧股骨区域附近,用于评估浸润,一个在区域内髌骨和股骨之间的关节腔用于评估渗出物。使用Leica Application Suite软件(Leica Microsystems)测量渗透物中细胞的量作为高于固定阈值的阳性区域。使用ImageJ软件(National Institutes of Health,Bethesda,MD,USA)的细胞计数器插件计数渗出物中阳性细胞的数量。使用Leica Application Suite软件(Leica Microsystems)测量渗透物中细胞的量作为高于固定阈值的阳性区域。使用ImageJ软件(National Institutes of Health,Bethesda,MD,USA)的细胞计数器插件计数渗出物中阳性细胞的数量。使用Leica Application Suite软件(Leica Microsystems)测量渗透物中细胞的量作为高于固定阈值的阳性区域。使用ImageJ软件(National Institutes of Health,Bethesda,MD,USA)的细胞计数器插件计数渗出物中阳性细胞的数量。

流式细胞术分析
通过用培养基冲洗骨髓腔并使细胞悬浮液通过细胞过滤器,从小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓。裂解红细胞后,将骨髓细胞与Fc阻断抗体(BD Pharmingen antimouse CD16 / CD32,克隆2.4G2; BD Biosciences,San Jose,CA,USA)一起孵育,然后用以下抗体混合物染色:CD11b-异硫氰酸荧光素,CD90.2-藻红蛋白(PE),CD45R / B220-PE,CD49b-PE,NK1.1-PE,Ly6G-PE,Ly6C-别藻蓝蛋白 - 花青7(均为BD Biosciences)。用CyAn流式细胞仪(Beckman Coulter Life Sciences,Indianapolis,IN,USA)获取样品,并用Kaluza分析软件(Beckman Coulter Life Sciences)进行数据分析。我们使用的门控策略在附加文件2中描述  。

骨髓来源的破骨细胞分化
从小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓。将总骨髓细胞以10 5个细胞/孔的密度接种到96孔板中的150μlα-最低必需培养基(Thermo Fisher Scientific)中,补充有5%FCS,青霉素/链霉素,30ng / ml重组体。小鼠(rm)M-CSF和20ng / ml rmRANKL(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)。培养基在3天后更新。

测量上清液中的TRAP活性
分化5天后收集细胞上清液,用比色测定法测量TRAP活性。简而言之,将磷酸对硝基苯酯(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)在含有420mM乙酸(Sigma-Aldrich)和160mM酒石酸盐溶液(Merck,Kenilworth,NJ,USA)的缓冲液中稀释并加入1: 1培养上清液。1小时后,用0.5M NaOH(Sigma-Aldrich)终止反应,并使用分光光度板读数器(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)测定405nm处的吸光度。

RNA分离和qRT-PCR
如前所述,从发炎的小鼠膝关节中分离出明确的滑膜样品[ 40 ]。使用MagNA Lyser Instrument(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN,USA)将组织样品匀浆。使用RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit(Qiagen,Hilden,Germany)分离总RNA。用TRIzol试剂(Sigma-Aldrich)分离来自破骨细胞培养物的RNA。随后将RNA逆转录成互补DNA。使用Applied Biosystems StepOnePlus RT-PCR系统(Thermo Fisher Scientific,Foster City,CA,USA)进行qRT-PCR。引物序列列于表  1中(引物自Biolegio,Nijmegen,the Netherlands)。甘油醛3-磷酸脱氢酶(Gapdh)用作参考基因。样品标准化为表达GAPDH通过计算比较阈:-Δ Ç 吨  = - (ç 吨感兴趣的基因- Ç 吨 GAPDH)。
表格1

统计分析
两组间的统计学差异使用Student's t检验计算参数变量(信使RNA [mRNA]表达,IgG滴度)或Mann-Whitney U检验非参数变量(淋巴细胞刺激试验/任意炎症评分,PG耗竭和S100A8)染色/破骨细胞前体的百分比/体内TRAP阳性细胞的数量/上清液中的TRAP活性/ NIMPR14-和F4 / 80-阳性细胞的定量/非软化钙化组织的百分比)。为了比较体外分化后体内骨侵蚀和TRAP +细胞定量中的多个组,使用双向方差分析。Spearman的秩相关系数(r S.计算相关性分析。所有分析均使用Prism版本5.03软件(GraphPad Software,La Jolla,CA,USA)进行,并且小于0.05的P值被认为是显着的。

结果
与WT对照相比,FcγRI,II,III,IV - / -小鼠的骨侵蚀减少
首先,为了确定在实验性关节炎期间不存在FcγR对骨吸收的影响,我们在FcγRI,II,III,IV - / -小鼠及其WT对照中诱导AIA后评估骨侵蚀。在AIA诱导后第7天和第21天,我们观察到与其WT对照相比,FcγRI,II,III,IV - / -小鼠的骨侵蚀显着减少,突出了FcγR在该过程中的重要性(图  1) 。然而,虽然FcγRI,II,III,IV - / -的骨侵蚀显着减少与WT对照相比,小鼠的分数没有降低到幼稚小鼠的相同水平。为了研究由于不存在FcγR而可能的基础表型,我们确定了没有AIA 的WT和FcγRI,II,III,IV - / -小鼠的膝关节中的骨侵蚀。这表明这些幼稚膝关节的骨侵蚀基础水平相当(图  1b)。另外,在胶原中存在的股骨和胫骨(附加文件noncartilage组织的表面积没有发现差异  1 b)中。总之,这些发现表明在FcγRI,II,III,IV中观察到的骨吸收减少- / -诱导实验性关节炎后的小鼠不能通过潜在的基底骨表型来解释。作为关节损伤的附加读数,我们评估了PG耗竭作为髌股和胫股区域炎症诱导的软骨破坏的量度。与减少的骨损伤线,我们观察到在FcγRI的,II,III降低PG耗尽,IV - / -小鼠在AIA诱导后第7天和第21天它们的WT对照相比,特别是在胫骨股骨区域(附加文件  1 Ç )。
图。1

在WT和FcγRI,II,III,IV - / -小鼠中针对mBSA的可比较的免疫应答
因为AIA模型的诱导高度依赖于针对mBSA抗原的免疫应答,所以我们开始确定针对mBSA的体液和细胞免疫应答是否受到FcγRI,II,III,IV的缺乏的影响。因此,我们测定了AIA小鼠血清中的抗mBSA IgG滴度。我们发现与WT小鼠相比,FcγRI,II,III,IV - / -小鼠中总IgG,IgG1和IgG2a的滴度增加,但IgG2b的滴度相当(图  2a)。此外,在关节中使用针对IgG的免疫染色,我们在WT和FcγRI,II,III,IV - / -小鼠中均显示IgG积累(图  2b)。最后,我们观察到相似的mBSA诱导的T细胞增殖从FcγRI,II,III,IV - / - 获得和WT小鼠(图  2c)。
图2

不存在Fcγ受体不会影响破骨细胞前体的数量
在下一组实验中,我们旨在阐明在不存在FcγR的情况下观察到的骨侵蚀减少的机制。我们首先确定FcγRI,II,III,IV - / -小鼠在诱导AIA后其骨髓中是否具有不同百分比的破骨细胞前体。的CD11b的百分比POS的Ly6C 高和CD11b 低/负的Ly6C 高细胞,这两者已显示出分化成破骨细胞[ 41,42的FcγRI,II,III,IV之间],是可比较的/ - -小鼠和WT小鼠(图。  3A)。这些数据表明观察到的骨侵蚀减少不是源于破骨细胞前体细胞群的差异。
图3

在AIA期间,Fcγ受体的缺失不会影响骨破骨细胞的破骨细胞生成能力和骨破骨细胞的数量
接下来,我们确定来自FcγRI,II,III,IV - / -小鼠的破骨细胞祖细胞是否具有与WT细胞相同的破骨细胞潜能。在用M-CSF和RANKL体外将骨髓细胞分化成破骨细胞后,我们观察到具有WT和FcγRI,II,III,IV - / -细胞的培养物中相当数量的多核TRAP +细胞(图  3b)。与此结果一致,我们发现关键破骨细胞分化标志物的mRNA表达水平相当,如活化T细胞核因子,细胞质1(Nfatc1),TRAP,树突状细胞特异性跨膜蛋白(Dcstamp),降钙素受体(Ctr))和破骨细胞相关的免疫球蛋白样受体(Oscar),以及活化标记物的可比mRNA表达水平,如氯离子通道7(Clcn7),碳酸酐酶II(Ca2),基质金属肽酶9(Mmp9)和组织蛋白酶K(Ctsk)(图  3c)。此外,在破骨细胞培养物的上清液中测量的TRAP酶活性是可比较的(图  3d)。总之,这些发现表明不存在FcγR不会影响前体细胞的破骨细胞形成潜力。最后,因为体内破骨细胞生成是一个可受许多因素影响的复杂过程,我们使用TRAP染色确定了AIA期间FcγRI,II,III,IV - / -和WT小鼠骨表面上的破骨细胞数量。有趣的是,与其体外可比的破骨细胞形成潜力一致,在AIA诱导后第7天和第21天,沿着骨表面的TRAP +细胞数量在FcγRI,II,III,IV - / -和WT小鼠之间没有差异(图  3e)。

FcγRs差异调节关节中存在的嗜中性粒细胞的流入
因为促炎细胞及其产品可以强烈增加破骨细胞的再吸收活性,我们评估了关节炎膝关节炎症的严重程度。在AIA诱导后第7天,FcγRI,II,III,IV - / -小鼠的膝关节中的浸润和渗出物的程度显着降低(图  4)。在诱导后第21天,两种菌株的炎症程度均降低,并且在FcγRI,II,III,IV - / -之间未观察到显着差异。和WT老鼠了。在AIA期间炎症的早期阶段(第7天)的特征在于渗出物中充分存在中性粒细胞和膝关节中的浸润。有趣的是,我们观察到渗出物中NIMPR14阳性中性粒细胞数量显着减少,并且FcγRI,II,III,IV - / -小鼠中浸润物中的NIMPR14阳性区域显着低于WT小鼠(图  5a)。相比之下,渗出物和浸润物中F4 / 80阳性单核细胞/巨噬细胞的数量在FcγRI,II,III,IV - / -和WT小鼠之间是相当的(图  5b),并且F4的百分比增加的趋势FcγRI,II,III,IV - / -的渗透/ 80细胞观察小鼠。我们实验室开发的先前数据显示,与我们在本研究中描述的FcγRI,II,III,IV - / -小鼠中炎症和骨吸收减少相反,FcγRI,II,III - / -小鼠显示骨吸收增加与诱导AIA后的WT对照相比,还有更多的炎症[ 29 ]。值得注意的是,我们观察到这些FcγRI,II,III - / -小鼠的渗透物和渗出物中存在的嗜中性粒细胞数量显着增加和趋势增加(图  5c)。然而,与我们在FcγRI,II,III,IV - / - 中的发现一致小鼠,Fγ/ 80阳性单核细胞/巨噬细胞数量在FcγRI,II,III - / -和WT小鼠之间没有显着差异,并且FcγRI,II,III 中F4 / 80阳性区域的百分比降低- / -小鼠(图  5d)。代表性的显微照片显示在附加文件  3和4中。总之,这些发现表明FcγRIV在嗜中性粒细胞募集到关节炎关节中可能特别重要,并且这些中性粒细胞可能有助于骨侵蚀过程。
图4

图5

产生S100A8 / A9的嗜中性粒细胞的数量与骨侵蚀的量强烈相关
与其关节中存在的中性粒细胞数量减少一致,在FcγRI,II,III,IV - / -中观察到S100A8在mRNA和蛋白水平上的表达水平低于WT小鼠(图  6a和b)。)。此外,与FcγRI,II,III - / -小鼠关节中观察到的更多中性粒细胞一致,我们实验室的研究人员先前描述了S100A8的表达增加[ 24]]。支持我们认为中性粒细胞产生的S100A8在观察到的骨侵蚀中发挥重要作用的观点,我们发现浸润和渗出物中的中性粒细胞数量以及它们的S100A8产生与骨的严重程度强烈且显着相关。侵蚀(图  6c和d)。
图6

讨论
在本研究中,我们显示FcγRs在AIA期间与骨侵蚀密切相关。此外,我们显示所有FcγR的缺失不影响破骨细胞前体的数量或其破骨细胞形成潜力,但是它通过减少炎症减少了实验性关节炎期间随后的骨侵蚀。在FcγRI,II,III,IV - / -和FcγRI,II,III - / -小鼠中AIA的发展的比较表明FcγRIV在AIA期间介导中性粒细胞炎症中可能的关键作用。

我们观察到缺乏所有FcγR的小鼠在第7天减少了炎症并且在诱导疾病后第7天和第21天减少了骨侵蚀。这与Hobday及其同事先前的一项研究一致,该研究表明FcγRI,II,III,IV - / -小鼠在宏观水平上完全免受血清转移的关节炎的影响[ 43 ]。然而,与该血清转移模型相反,AIA模型的特征在于明显的T细胞受累,其可能是FcγR非依赖性的。这可以解释为什么我们没有观察到FcγRI,II,III,IV中的完全保护- / -老鼠。在另一项研究中,与我们在FcγRI,II,III,IV - / - 小鼠中观察到的一致,y链/FcγRIIb - / - 小鼠缺乏激活和抑制性FcγR以及使用γ的其他受体的信号传导。虽然没有报告骨侵蚀数据[ -14 ] ,但链完全受到CIA发展的保护。

AIA实验性RA模型的诱导高度依赖于含mBSA /抗mBSA的IC与FcγR的结合,从而有效激活细胞,并激活针对mBSA的T细胞应答。然而,我们观察到在FcγRI,II,III,IV - / -和WT动物中针对mBSA抗原的相当的T细胞应答,这表明它们对模型诱导的贡献不受FcγR缺失的影响。这是与以前的研究中,正常的T细胞应答中发现在不存在任一活化或抑制性FcγR的的AIA [诱导后一致的27,28 ]。总之,这些发现表明T细胞免疫应答的发展是FcγR非依赖性的。

先前已经表明,不存在对FcγRIIb的往往导致在由于对由浆细胞产生的IgG的缺乏负反馈,这导致免疫应答的增强的刺激的小鼠增加的IgG滴度28,45 ]。与这些发现一致,本研究中使用的FcγRI,II,III,IV - / -小鼠(其也缺乏FcγRIIb)与其WT对照相比显示出增加的IgG滴度(总IgG,IgG1,IgG2a)。此外,IgG的积累存在于FcγRI,II,III,IV - / -小鼠的关节中。总之,这些数据显示针对mBSA的正常T细胞应答和FcγRI,II,III,IV中的IgG滴度增加- / -小鼠表明观察到的骨病理学减少不能是诱导AIA模型后针对mBSA的免疫应答不足的结果。

破骨细胞是RA中负责骨组织降解的主要细胞。虽然已知破骨细胞在M-CSF和RANKL的影响下与骨髓来源的骨髓前体分化,但尚未鉴定出严格定义的破骨细胞前体组[ 4 ]。据报道,CD11b pos Ly6C 高骨髓单核细胞在体外用M-CSF和RANKL刺激时可分化为破骨细胞,而体内Ly6C 高细胞的消耗导致K / B×N血清中破骨细胞形成减少和随后骨吸收减少转移模型[ 41 ]。此外,查尔斯及其同事最近确定了CD11b 低/负 Ly6C hi骨髓细胞在体外和体内均具有破骨细胞形成潜力[ 42 ]。在本研究中,我们未观察到FcγRI,II,III,IV - / -和WT小鼠之间Ly6C 高和CD11b 低/阴性 Ly6C 高破骨细胞前体群体的相对百分比的差异,这使得我们排除了在FcγRI,II,III,IV - / -小鼠中减少骨侵蚀的可能性仅仅是破骨细胞前体数量减少的结果。

在M-CSF和RANKL信号旁边,通过激活ITAM结构域的共刺激信号,其存在于γ链和12kDa的DNAX活化蛋白(DAP-12)中,是激活NFATc1所必需的,其是转录因子对破骨细胞分化[必不可少46,47 ]。因为活化FcγRI,FcγRIII和FcγRIV由破骨细胞表达并且与含有ITAM的γ链相关,它们可能会影响破骨细胞分化。然而,在本研究中,我们发现缺乏所有四种FcγR不会影响体外破骨细胞与其前体的分化。Negishi-Koga及其同事强调了我们的研究结果,表明FcγRIIb - / - /γ链- / -缺乏活化和抑制性FcγR信号传导的细胞未显示破骨细胞分化的改变。然而,先前已经描述了关于FcγR对破骨细胞生成的影响的不同结果。令人惊讶的是,Negishi-Koga及其同事报道FcγRIII - / -小鼠的骨质疏松表型与破骨细胞数量增加有关。这些作者还证实了FcγRIII - / -骨髓细胞的体外破骨细胞分化增加,共同表明FcγRIII在破骨细胞生成中具有抑制作用[ 48]。]。他们指出,这一惊人发现的机制基础可能是FcγRIII对γ链的螯合作用。因此,在没有FcγRIII的情况下,更多的γ链可用于其他蛋白质,如破骨细胞相关的免疫球蛋白样受体(OSCAR)和配对的免疫球蛋白样受体A(PIR-A),它们都可作为共刺激因子。破骨细胞生成通过它们与γ链的结合。此外,同一研究组显示,缺乏抑制促破骨细胞原性ITAM信号传导的ITIM结构域的FcγRIIb - / -细胞显示出增加的破骨细胞形成潜力。因此,在本研究中,我们显示FcγRI,II,III,IV - / -细胞具有正常的体外破骨细胞形成能力,我们不能排除通过γ链依赖性共刺激途径对破骨细胞分化的代偿作用,例如通过OSCAR或PIR-A信号传导,或通过在骨髓细胞2(TREM2)上表达的触发受体,这取决于含有DAP12蛋白的ITAM结构域的信号传导。与此可能性一致,已显示DAP12主要负责体外M-CSF-和RANKL-诱导的破骨细胞生成,因为γ-链- / -细胞显示正常分化。然而,在不存在的DAP12,在γ链可以补偿它的缺失,通过α作用v β 3整联49 ]。

最后,强调我们在体外观察到的正常破骨细胞分化,非关节炎FcγRI,II,III,IV - / -小鼠的膝关节没有基底骨表型,测量为股骨和胫骨中软骨下钙化组织的数量,以及我们观察到AIA诱导后沿骨表面的TRAP +破骨细胞数量相当。总之,这些发现暗示所有FcγR的缺失不会损害细胞分化成成熟破骨细胞的能力,这表明破骨细胞活性的差异,而不是破骨细胞数量的差异,必须成为FcγRI,II,III侵蚀减少的基础。在研究的AIA模型中,IV - / -小鼠。

已经表明,炎症通过产生过多的因子在体内激活破骨细胞中起关键作用,这些因子以这种方式导致骨侵蚀。在该研究中,我们发现,与第7天的WT对照相比,FcγRI,II,III,IV - / -小鼠的炎症(浸润和渗出)均降低,但在AIA诱导后不在第21天。这表明FcγR可能最多地参与AIA模型的早期炎症反应,其仍然导致在诱导后第21天FcγRI,II,III,IV - / -小鼠中的骨侵蚀显着减少。

已经显示小鼠中的四种FcγR在免疫细胞上差异表达,并且已知各个FcγR以不同的亲和力结合各种IgG亚类[ 10 ]。IgG1的活性主要依赖于FcγRIII,并且IgG2a以高亲和力结合FcγRI并且对FcγRIII和IV具有低亲和力,而IgG2b以对FcγRIV的最高亲和力结合。这意味着缺乏一种或多种FcγR和细胞组合物可能比正常情况下更容易促进IgG与其他FcγR的结合,可能导致异常的细胞内信号传导。以前的研究人员使用缺乏一种或多种FcγR的小鼠研究了FcγR在AIA中的作用。FcγRIIb中AIA的诱导- / -小鼠导致增加的炎症,最有可能的情况下都FcγRIIb的介导的IgG间隙和由B细胞[关于IgG产生的负反馈回路的,因为28,29 ]。相比之下,FcγRI - / -或FcγRIII - / -小鼠的炎症没有受到影响[ 28 ],这表明这两种受体可以补偿彼此的缺失,或者两种情况下FcγRIV都是显性FcγR。然而,联合不存在FcγRI和FcγRIII[ 24 ]导致炎症减少。有趣的是,当缺乏IgG清除FcγRIIb时,导致FcγRI,II,III - / -小鼠,存在更强的IC积累,这可能通过IC与FcγRIV的结合导致炎症增加[ 29 ]。除了FcγRI,FcγRII和FcγRIII之外,当FcγRIV也不存在时,发现炎症减少,从而证实了FcγRIV在这种情况下的重要功能。虽然我们的结果表明FcγRIV在AIA病理学中的重要作用,但确凿证据应来自FcγRIV单敲除中的AIA诱导。与我们在AIA模型中的发现一致,35-40%的FcγRI,II,III - / -小鼠发展为CIA,而γ链- / - /FcγRIIb - / -还缺乏功能性FcγRIV的小鼠免于疾病发展,进一步支持FcγRIV在该关节炎模型中的作用[ 44 ]。此外,对于FcγRIV在K / B×N中的重要参与的明确证实来自Seeling及其同事的研究,其中FcγRIV - / -动物显示炎症和骨侵蚀显着减少[ 41 ]。最后,除了FcγRIV外,在缺乏所有FcγR的小鼠中使用抗FcγRIV的阻断抗体可以预防关节炎的发展[ 50 ]。

总之,这些研究和本文报道的数据表明,在实验性RA模型中,重要的作用可能归因于FcγRIV。有趣的是,FcγRIIIA中的多态性(其是鼠FcγRIV的人直系同源物)与RA发展的易感性增加有关。该多态性,其中苯丙氨酸代替在氨基酸位置158缬氨酸(158 V / F),位于所述的免疫球蛋白结合结构域,导致受体的亲和力增加了IgG1和IgG3抗体以外[ 51,52,53]。虽然这些关联不能在所有人群中复制,但这些数据支持了鼠FcγRIV的人直系同源物在RA发展中的可能重要作用,并进一步支持了其他研究在研究FcγR在RA中的作用的重要性[ 54 ]。

在我们目前的研究中,我们描述了FcγRI,II,III - / -小鼠中渗透和渗出物中中性粒细胞数量的明显增加,而在FcγRI,II,III,IV - / -小鼠中观察到中性粒细胞数量减少。。这表明特别是FcγRIV是造成关节中性粒细胞存在的原因。中性粒细胞在RA发展中的重要性已在K / B×N实验RA模型中显示[ 31 ]。此外,与此角色在实验RA模型,嗜中性粒细胞的协议,嗜中性粒细胞的高数是存在于患者的关节的活动性RA [ 32,33]。我们显示关节中存在的中性粒细胞数量与骨侵蚀量之间存在显着且显着的相关性。因为在AIA模型中,IC在关节中局部产生,我们提出IC可以通过FcγRIV刺激滑膜巨噬细胞以释放趋化因子,例如补体成分和角质形成细胞衍生的趋化因子,从而诱导中性粒细胞募集到关节中。中性粒细胞是警报器S100A8 / A9的强有力生产者,已证明其通过TLR4信号传导直接诱导体外破骨细胞活性[ 39 ]。这表明渗透的中性粒细胞可以调节RA中的骨侵蚀的机制。实际上,我们观察到S100A8的低表达水平与FcγRI,II,III,IV - / -关节中较低的中性粒细胞数一致。小鼠比WT小鼠。此外,我们观察到中性粒细胞产生S100A8与骨侵蚀的严重程度强烈且显着相关。与这些发现一致,我们的实验室先前显示,在AIA诱导后其关节中中性粒细胞数量增加的FcγRI,II,III - / -小鼠显示S100A8表达增加。S100A8 / A9已显示在患者的滑液与RA [被强烈上调37,38 ],其电平被链接到关节的炎症和损伤[ 55,56,57,58]。总之,这些数据支持了FcγRIV通过调节产生S100A8 / A9的中性粒细胞流入关节炎关节来介导AIA骨侵蚀的观点,尽管不能完全排除IC对破骨细胞的额外直接影响。

结论
我们目前的研究为现有的关于FcγR参与诱导骨侵蚀的知识体系增加了重要的新数据,特别是我们第一次知道,在AIA期间FcγRIV在中性粒细胞介导的骨侵蚀中的作用。

缩略语
友邦保险: 
抗原诱导的关节炎

 CFA: 
完全弗氏佐剂

中央情报局: 
胶原蛋白诱导的关节炎

 DAP-12: 
12kDa的DNAX活化蛋白

FcγR的: 
Fcγ受体

 Gapdh : 
甘油醛3-磷酸脱氢酶

 我知道了: 
免疫复杂

IgG抗体: 
免疫球蛋白G.

 ITAM: 
激活基序免疫受体酪氨酸激活基序

ITIM: 
基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序

 MBSA: 
甲基化牛血清白蛋白

M-CSF: 
巨噬细胞集落刺激因子

 表达: 
信使RNA

 NS: 
不重要

奥斯卡: 
破骨细胞相关的免疫球蛋白样受体

 PE: 
藻红蛋白

 PG: 
蛋白多糖

PIR-A: 
配对的免疫球蛋白样受体A.

 RA: 
类风湿关节炎

RANKL: 
核因子-κB配体的受体激活剂

 RF: 
类风湿因子

陷阱: 
抗酒石酸酸性磷酸酶

 TREM2: 
在骨髓细胞上表达的触发受体2

 WT: 
野生型

声明
致谢
我们非常感谢欧洲联盟第七框架计划Osteoimmune项目(289150号文件)提供的财政支持。

附加文件

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