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Wnt5a介导补肾活血汤对骨髓间充质干细胞体外迁移的影响

学术文章|来源:BMC|作者:魏申,惠罗,徐亮亮,... 评论(0)

关键词

  • 断裂
  • 补肾活血汤
  • 骨髓间充质干细胞
  • 移民
  • 的Wnt5a

背景

骨折会严重影响患者的生活质量。许多患者患有骨折,骨折既昂贵又需要很长时间才能愈合。骨折愈合是一个非常复杂的修复过程,类似于胚胎发育[ 1]。延迟愈合或骨折愈合不良对患者的生活质量构成严重威胁。骨折通过两种机制修复:直接和间接骨修复。间接骨折愈合由即时炎症反应引发,其导致骨髓间充质干细胞(BMSC)募集至损伤部位。凝结是骨骼和其他间充质组织发育的关键阶段。它发生在先前分散的细胞群聚集在一起以分化成单个细胞/组织类型,如软骨,骨骼,肌肉[ 2 ]。BMSCs随后分化为软骨细胞,软骨细胞产生软骨并形成愈伤组织[ 3]。当间充质细胞形成涉及不同细胞过程(迁移,粘附,增殖和生长)的凝结时,骨形成开始[ 2 ]。通过鉴定从骨损伤区域释放的相关细胞因子和趋化因子,可以激活壁龛中的BMSC并迁移至损伤区域[ 4 ]。因此,干预措施可以加速BMSC迁移过程,并可能有助于骨修复。

Wnt信号传导途径可分为两类:经典(Wnt /β-连环蛋白依赖性)途径和非经典途径。非经典Wnt信号传导途径包括Wnt / PCP和Wnt /蛋白激酶C(PKC)-Ca 2+途径[ 5 ]。两个途径都与细胞粘附和运动[ 6,7 ]。的Wnt5a激活后者途径[ 6,8,9 ],并与细胞运动性和侵袭[密切相关的10。

补肾活血汤(BHD)已经被用于治疗疾病颅脑和卵巢疾病[ 11,12,13 ],可用于治疗骨疾病如骨关节炎和骨质疏松症[有益的14,15]。BHD由清朝的朱权泉首先描述。从那时起,它已被广泛用于骨折患者,尤其是老年患者。根据中医认为,BHD可促进血液循环,有助于缓解骨折部位的肿胀,加速骨修复。研究表明,BHD治疗组可明显通过的Wnt /β-catenin信号途径的活化促进分化,增殖和成骨细胞的矿化,并且还可以改善在兔实验性软骨代谢和拮抗过氧化损伤[具有骨chondric保护作用16,17]。在我们之前的研究中,我们比较了用四种不同溶剂(石油醚,乙酸乙酯,无水乙醇和水)提取的BHD处理的BMSCs的迁移能力。我们发现用石油提取的BHD以剂量依赖的方式诱导细胞迁移的最大改善[ 18 ]。但是,潜在的机制仍然未知。这项研究的目的是探索这种未知的机制。我们假设BHD通过激活Wnt5a促进细胞迁移能力。

方法

报告清单的最低标准包含实验设计,统计数据和本研究中使用的资源的详细信息(附加文件1)。

BHD制剂和草药成分的检测

11种中药材(熟地黄18克,C丝子18克,补骨脂18克,杜仲6克,山茱萸6克,肉桂菜6克,枸杞子6克,白芷6克,当归6克) ,Myrrha 6克,Flos Carthami 3克)购自广州中医药大学第三附属医院。在干燥24小时并粉碎成粉末后,用滤纸包裹总草药并转移到Soxhlet装置中。使用石油中的索氏提取法提取组分[ 19]]。通过旋转蒸发和石膏沉淀浓缩萃取物,称重产物。将1克溶解在石油中并通过气相色谱 - 质谱(GC-MS)分析。将剩余产物溶解在二甲基亚砜中,并在使用前通过0.22-μm注射器过滤器(Millex-GP,USA)过滤。储存溶液的浓度为400μmol/ ml,并在使用前稀释至所需浓度。

BMSC分离和培养

本研究经广州中医药大学动物保护与使用委员会批准。在无菌环境(n = 30)中从Sprague-Dawley大鼠(雄性,4周龄,60-80g)分离BMSC。通过吸入二氧化碳使大鼠安乐死。用无血清低葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)冲洗双侧股骨和胫骨轴的骨髓以获得单细胞悬液。将获得的骨髓溶液以1200rpm离心6分钟,除去上清液,将细胞沉淀重悬于补充有10%胎牛血清,1%β-巯基乙醇和1%青霉素和链霉素的葡萄糖-DMEM中(全部来自美国Gibco)。在原代培养24小时后丢弃培养基,然后每3天更换一次。在第4天,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗掉非粘附细胞,并使粘附细胞进一步扩增直至达到80%汇合。用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞,并在倒置显微镜下观察。当细胞变圆并脱落时,通过加入含有10%血清的低葡萄糖DMEM终止消化。制备单细胞悬浮液并以1:2的比例传代培养。将培养基更换几次以获得纯BMSC。来自第3至5代的细胞用于该研究。当细胞变圆并脱落时,通过加入含有10%血清的低葡萄糖DMEM终止消化。制备单细胞悬浮液并以1:2的比例传代培养。将培养基更换几次以获得纯BMSC。来自第3至5代的细胞用于该研究。当细胞变圆并脱落时,通过加入含有10%血清的低葡萄糖DMEM终止消化。制备单细胞悬浮液并以1:2的比例传代培养。将培养基更换几次以获得纯BMSC。来自第3至5代的细胞用于该研究。

成骨细胞和脂肪细胞分化

骨髓基质细胞进行培养,并在6孔板中接种升含有10%FBS和1%青霉素-链霉素的24小时-DMEM。当细胞融合时,培养基被成骨细胞培养基或脂肪细胞培养基取代。成骨细胞培养基含有10 -8 M地塞米松,10mMβ- 甘油磷酸和0.05 mM l-抗坏血酸(均来自Sigma-Aldrich,MO,USA),而脂肪细胞培养基含有10 -6 M地塞米松,0.5 mM异丁基甲基黄嘌呤,100 μM吲哚美辛和10mg / l胰岛素(均来自Sigma-Aldrich,MO,USA)。培养基每3天更换一次。第21天,进行茜素红和油红O染色观察BMSCs的分化。

BMSCs的表征

通过胰蛋白酶收获细胞,重悬于冷PBS中,然后与相应的FITC / PE缀合的抗体一起孵育用于干细胞标记物CD-90,CD-44,内皮标记物CD-34和造血标记物CD-45。 。使用BD FACSCanto流式细胞仪分析细胞。

检测细胞增殖

将BMSC以2×10 5 / ml 接种于96孔培养板中(每孔100μl培养基中约2000个细胞)。然后,加入100μl无血清培养基,饥饿细胞12小时。用含有不同浓度的BHD(0,1,10,25,50,100和150μg/ ml)的完全培养基替换培养基。24,48小时后,向每个孔中加入10微升CCK8染料,并将细胞再培养3小时。使用酶标仪在450nm波长下记录吸光度,以确定每个孔中的增殖水平(n = 6)。

划痕伤口愈合测定

将BMSC接种在6孔板中并培养至95%汇合。通过无血清的l - DMEM 将培养基置换12小时。用微量移液管尖端产生划痕伤口。用不同浓度的BHD(0,25,50,100和150μg/ ml)处理细胞,并在相差显微镜下观察划痕区域并拍照(n = 6)。

细胞迁移试验

使用孔径为8μm的Transwell板(Corning Costar,Cambridge)评估细胞迁移能力。将细胞消化并以1×10 5 / ml重悬于上室中的无血清培养基中。然后在200μl无血清培养基中向上室加载8×10 4个 BMSC。在培养箱中培养2小时后,向下室加载700μl含有不同浓度BHD的完全培养基。将板在37℃,5%CO 2中温育10小时 然后使用棉签轻轻刮擦膜的上表面以除去未迁移的细胞并用PBS洗涤。然后将膜在4%多聚甲醛中固定30分钟,然后用吉姆萨染色剂染色。观察迁移的细胞并在相差显微镜下拍照。通过平均每孔5个随机区域(n = 6)确定迁移细胞的数量。

慢病毒转染

为了获得具有沉默的Wnt5a表达的BMSC,培养BMSC并用Wnt5a特异性短发夹RNA(sh-Wnt5a)慢病毒载体转染。绿色荧光蛋白(GFP)在慢病毒中表达,并用于评估BMSC转导效率。通过定量RT-PCR测试转染效率。按照制造商的说明,在BMSC中进行转染,感染复数(MOI)为6:1。慢病毒载体购自GeneChem(中国上海)。12小时后,用完全培养基替换含有慢病毒载体的培养基。

实时PCR分析

根据制造商的说明书,使用TRIzol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)从BMSC中提取总RNA。使用紫外分光光度计(BioSpec-nano)测量RNA浓度。使用PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa,Tokyo,Japan)从总RNA产生cDNA。引物序列如表1所示  。分析Wnt5a,PKC,JNK和CaMKII的表达水平。ΔΔCt方法用于计算mRNA相对于GAPDH的表达。所有步骤均在无RNase条件下进行。

表格1用于RT-PCR的引物序列列表

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蛋白质印迹

对于Western印迹,我们使用RIPA缓冲液(Boston BioProducts,Ashland,MA,USA)来提取BMSC的总蛋白。通过BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce,Rockford,IL,USA)测量蛋白质浓度。通过10%SDS-PAGE分离等量的蛋白质样品(30μg),并电泳转移到PVDF膜(Millipore,Billerica,MA,USA)上。将PVDF膜在含有5%脱脂乳的TBST中封闭1小时,然后与小鼠抗-Wnt5a(1:1000,Abcam),兔抗SAPK / JNK(1:1000,CST),兔抗CaMKII( 1:1000CST),小鼠抗PKC(1:1000,Millipore)和兔抗GAPDH(1:4000,Abcam)一抗在4℃过夜。将膜在TBST中洗涤,并与相应的二抗在室温下孵育1小时。

统计分析

数据表示为平均值±SD。单因素方差分析用于多重比较。P <0.05的值被认为是统计学上显着的。

结果

分析草药配方:BHD化学成分

用石油醚提取的BHD送到广州中国分析中心,用GC-MS进行分析。在GC / MS谱图中显示总共45个峰。标准分析程序用于筛选成分。将组件的频谱与存储在NIST库版本中的频谱进行比较。洗脱的化合物根据其分子式,结构,保留时间和峰面积%进行表征。共反映出21个不同的峰。在指纹中发现了12种成分(图  1),并总结在表  2中。

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图1 GC-MS指纹显示BHD的活性成分

表2BHD的化学成分

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BMSCs的鉴定

骨髓基质细胞进行培养并传代,直至通道3他们表现出纺锤形细胞形态(图  2的a,b),和细胞具有成骨二者(图  2 c)和脂肪形成分化能力(图  2 d)。通过流式细胞术分析BMSC表面标志物。将细胞呈阳性CD90(98.63%)和CD44(98.48%),但表达CD34(0.25%)和CD45(0.25%)(图  2 e)所示,其中在形态上和免疫表表明,该细胞的BMSCs。

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图2一个的BMSCs表现出纺锤形细胞形态。b第3代BMSCs和95%汇合。c茜素红染色显示细胞能够成骨。d油红O染色显示细胞也是脂肪形成的。e细胞CD-44阳性,CD-90阳性,CD-34和CD-45阴性


不同浓度BHD治疗骨髓间充质干细胞

如图3所示,  当用100μg/ ml BHD处理BMSC 24小时和48小时时,细胞存活率达到峰值(图  3)。这些结果表明,低剂量BHD对细胞无毒,并且可在48小时内促进细胞增殖。

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图3细胞计数试剂盒-8用于检测细胞活力。暴露于高剂量BHD 24小时和48小时抑制细胞活力。用100μg/ ml BHD处理在24小时和48小时增加细胞活力。治疗组与对照组相比,* P <0.05,** P <0.01,*** P <0.0001(n = 6)


沉默Wnt5a抑制BMSC迁移

将不同浓度的BHD(150,100,50,25μg/ ml)加入Transwell板的下室中,并在染色和拍照后计数迁移的细胞。处理组显示出与对照组相比BMSC迁移的显著加速,特别是在100微克/毫升BHD组(图  4的A)。划痕伤口愈合测定法显示出相当的结果(图  4 b)中。为了观察BHD是否可以激活Wnt5a表达,用sh-Wnt5a转导BMSC。在通过慢病毒载体转染后(图  5a),收获sh-Wnt5a和sh-杂乱的BMSC并比较Wnt5a表达。sh-Wnt5a BMSCs表现出显着降低的Wnt5a表达(图  5C)。然后,进行一个Transwell小室法来比较与100微克/毫升BHD组的迁移能力(图  5 b)中,并将该数据表明,沉默的Wnt5a显著抑制骨髓基质细胞(图的迁移  5 d)。

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图4BHD治疗组显示出更强的迁移能力,尤其是100μg/ ml BHD组。一个 Transwell检测表明,BHD增强细胞迁移的能力。b刮伤愈合试验中的动态迁移。用100μg/ ml BHD处理的BMSC在愈合速度方面表现出优异的性能。c transwell测定和伤口愈合测定的数据。*治疗组与对照组相比,P <0.05

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图5沉默Wnt5a抑制BMSC迁移。一个绿色荧光蛋白用于证明转染效率。通过Wnt5a特异性短发夹RNA(sh-Wnt5a)慢病毒载体成功转染细胞。b对照组和sh-Wnt5a组均通过100μg/ ml BHD促进细胞迁移能力。沉默Wnt5a可降低细胞迁移能力。c通过实时PCR分析shRNA活性的效率。Wnt5a的表达显着降低。d transwell测定的数据* P <0.05,*** P <0.0001


BHD激活Wnt5a相关基因表达

为了确定BHD是否可以活化Wnt5a,我们用100μg/ ml BHD处理BMSC。的Wnt5a,SAPK / JNK和CaMKII的表达均显著在mRNA水平增加(图  6的A)。

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图6BHD激活Wnt5a及其相关途径。Wnt5a,JNK,PKC和CaMKII  mRNA表达。* P <0.05,** P <0.01,*** P <0.0001。b所有组中Wnt5a,SAPK / JNK,PKC和CaMKII的表达水平。数据显示BHD上调Wnt5a,SAPK / JNK,PKC和CaMKII


蛋白质印迹分析

在Wnt5a,SAPK / JNK,CaMKII和PKC的Western印迹分析中观察到蛋白质水平的可比较结果。数据显示一个平行结果与mRNA数据,这表明BHD可以作用于的Wnt5a和上调其信号传导蛋白,SAPK / JNK,CaMKII的和PKC(图  6的B)。

讨论

自清代朱祝全所描述以来,BHD已被用于促进中医医生的骨折愈合。由于其对骨折愈合的疗效,目前在中国作为骨折的补充治疗仍被广泛使用。在中国接受保守治疗的骨折患者更有可能使用BHD。中国的许多研究人员已经观察到其对各种类型骨折患者的影响。尽管其成功使用的历史悠久,但BHD促进骨折愈合的潜在机制仍然未知。在这项研究中,我们假设BHD通过激活Wnt5a信号通路促进骨愈合来增强BMSC迁移。BHD含有11种草药,煎煮后可获得其他活性成分。 2。一些研究表明BHD组分与骨病之间存在相关性,主要与骨折愈合有关。补骨脂酚,BHD的主要成份,表现出在体内和体外模型[表现出在两种雌激素活性 20, 21 ]。Sunyer等人。发现雌激素发挥了骨保护作用[ 22 ],这可能有助于骨折修复。补骨脂酚还具有抗微生物,抗炎,抗氧化,抗骨质疏松,抗抑郁或抗应激活性[ 23]。Osthole已被广泛研究用于骨骼疾病,因为它可能激活β-连环蛋白-BMP-2信号通路以调节体外成骨细胞分化[ 24]]。张等人。表明,蛇床子素通过增强软骨内骨化来促进修复的进展[ 25 ]。

已经报道了许多关于Wnt途径参与骨修复过程的研究[ 26 ],并且大多数与经典的Wnt /β-cat途径相关。然而,很少有研究发现非经典Wnt途径(如Wnt5a)在调节BMSCs迁移中的作用。Wnt5a途径分为九类,例如,Wnt5a /平面细胞极性(PCP)信号传导,Wnt5a / Ca 2+信号传导和Wnt5a /非典型PKC信号传导[ 27 ]。Wnt / PCP途径与脊椎动物中的Wnt5a相关,可以调节细胞迁移和插入[ 6 ]。Wnt / PCP途径启动信号级联,最终导致JNK激活最终转录因子c-JUN(AP1)[ 5],6 ]。Wnt5a途径的激活可以诱导细胞内钙的释放和靶蛋白(PKC)的上调。在本研究中,我们发现BHD处理的BMSCs在对照组中比在sh-Wnt5a组中表现出更好的迁移。Wnt5a,PKC,CaMKII和SAPK / JNK的表达在mRNA和蛋白质水平上显示出相似的趋势,这表明BHD激活Wnt5a / PCP和Wnt5a / PKC-Ca 2+途径以增强BMSC迁移能力。

结论

骨折愈合是一种独特的生理过程,BMSCs的迁移在炎症和血肿阶段是必不可少的。从古代到现在,草药在中国疾病治疗中发挥了重要作用,取得了显着成效。随着现代医学,尤其是外科技术的发展,中草药治疗往往可以在临床治疗中发挥辅助作用。例如,BHD有助于愈合骨折。在本研究中,我们研究了BHD对BMSC迁移的影响,并发现BHD通过激活Wnt5a信号通路促进BMSC迁移。需要进一步研究以确定哪种草药成分对治疗效果的这种改善起作用。

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