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伤口软膏(WO)的化学表征及其对骨折修复的影响:兔模型

学术文章|来源:BMC|作者:Zhixue Ou,七成,陈跃平... 评论(0)

关键词


  • 动物
  • 破骨细胞
  • 骨折愈合
  • 伤口软膏(WO)
  • 桡骨骨折
  • VEGF


背景

骨折是一种非常常见的疾病,通常由高力,压力或轻微创伤引起。女性的男性1.17%和1.07%的平均骨折的发生率据报道,在英国和超过600万例发生在美国每年[ 1 - 4 ]。骨折愈合是一个复杂的过程,包括肉芽组织形成,软骨愈伤组织形成,板层骨沉积和原始骨骼轮廓的重塑。手术治疗是最常见的骨折治疗方法,而老年人群仍存在发病率和死亡率的风险[ 5]。因此,寻找更安全和更有效的骨折治疗方法至关重要。血管内皮生长因子(VEGF)是生长因子的亚家族成员,其对血管发生和血管生成过程都很重要。另外,它已经被广泛接受的是,VEGF通过加速血管生成的过程中,已经通过几种动物模型确认以及发挥骨再生至关重要的作用[ 6,7 ]。有足够的证据支持了VEGF蛋白的高表达可加速股骨骨折的小鼠和补救半径节段性缺损兔愈合[ 8,9 ]。

云南白药(YNBY)是中草药最受欢迎的处方之一,具有开放和闭合伤口的止血功能。由于其着名的止血功能,它被认为是中国内外出血以及开放和闭合伤口的“急救”必备疗法。也有人报告说,YNBY可以有效地通过两个免疫抑制和创伤愈合的机制[减少鼠实验性结肠炎的严重性10 12 ]。,11,

伤口软膏(WO)由中草药制成,含有三七,三七,大黄和大黄等。这些草药具有协同作用的活性成分,可减轻疼痛,预防感染,促进愈合,副作用少。在几种WO中加入抗菌成分和镇痛剂以痛苦地治疗伤口和预防感染。一些不常见的软膏富含维生素,包括维生素E,维生素A和维生素D,可以通过擦伤,割伤和烧伤促进皮肤愈合。

WOs的主要用途是治疗软组织损伤,加速血液循环,缓解充血,肿胀和疼痛。WO还具有抗炎和抗菌作用,对皮肤,心脏,肝脏,肾脏和其他器官无刺激。在传统消毒后,WO可以直接穿着,或涂在纱布上。它首先被中国中医家[应用于骨折再生13,14 ]。随着临床应用30年,WO对骨的确认工会的积极作用,并发挥在中国和东南亚地区[有一定影响15,16]。然而,没有相关的动物实验或临床研究来系统评价其对骨折愈合的疗效,并且由于缺乏研究,其功能机制仍然为公众所知。上述这些因素在很大程度上限制了WO在临床上的广泛应用。因此,在本研究中,我们利用兔子进行桡骨骨折模型研究了WO对骨折愈合的影响,并说明了WO的潜在机制。

方法

样品溶液的制备

使用索氏提取器用40mL甲醇提取总共4.0g的WO样品12小时直至完全提取。然后,将溶液过滤并蒸发。将粗残余物与5mL甲醇均匀混合用于进一步分析。

液相色谱 - 质谱分析(LC-MS)

使用Waters Acquity UPLC系统(Waters,Milford,MA,USA)与TOF质谱仪(Bruker,Bremen,Germany)偶联进行LC-MS。使用Hystar软件(Bruker)获得结果。Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7μm)用作固定相,0.1%甲酸的纯水(A)和0.1%甲酸的乙腈(B),流速为0.4 mL / min被用作流动相。条件如下:0-1分钟,5%B; 1-4分钟,20%B; 4-6分钟,25%B; 6-10分钟,40%B; 10-12分钟,60%B; 12-15分钟,100%B; 15-16分钟,40%B; 16-20分钟,5%B。柱温保持在40℃,每个样品的注射体积为2μL。

质谱仪在负模式下操作,扫描范围为m / z,从100到3000.质量条件如下:气体(N 2)流速为8L / min,温度为180℃; 毛细管电压为4500 V.

动物模型和骨折手术

新西兰白兔54只(由中国广西中医药动物中心提供),10个月大,体重2.0-2.5千克,参与本研究。在气候控制条件下(25℃; 55%湿度; 12小时光与12小时黑暗交替),将所有兔子单独饲养并用标准实验室饮食和自来水喂养。从每只兔子的背部和右前肢切除一小块皮肤真皮。在将麻醉剂(30mg / mL,戊巴比妥钠溶液,Sigma-Aldrich,MO,USA)注射到兔耳静脉中之后,在处于仰卧位的兔子的消毒区域中进行以下所有程序。制作1.5cm的纵向切口以暴露半径的中间部分。切下骨膜并剥离,然后露出径向轴。通过骨骼剪切建立骨折模型,保留外周血管,肌肉和软骨组织,保持尺骨整合。该研究经广西中医药大学附属瑞康医院伦理委员会批准。最低报告标准清单包含本研究中使用的实验设计,统计和资源的详细信息(附加文件1)。

分组和治疗

将兔分为三组(每组n = 18)。对照组仅接受生理盐水对照组,云南白药(YB,云南白药集团有限公司,云南,中国)治疗组为YB组,WO组为接受WO治疗的兔(瑞康医院)到广西中医药大学,广西,中国)。每天三次将5毫克/千克的YB和WO外用于骨折,并且每隔3天更换敷料并更换敷料。对照组的骨折部分在没有任何药物的情况下包扎。

标本的制备和处理

通过向注射器中注射10-15mL空气,在不同时间点(手术后3,7,14,21,28,35天)处死兔子。在立即切断骨折的皮肤后,剥离周围的肌肉,肌腱和其他软组织。增生性软组织,纤维和骨骼愈伤组织减半。将一部分固定在10%中性福尔马林溶液中,并准备用于以下HE染色和IHC分析; 另一部分用锡箔包裹并储存在-80℃下用于蛋白质印迹。在10分钟内完成兔子的处死和标本的保存,以防止蛋白质降解和细胞自溶破裂。

射线照相分析

的透视和微CT观察步骤类似于以前的研究[ 17,18 ]。简言之,通过数字X射线设备(Siemens,Chicago,USA)检测断裂形态。渲染三维(3D)图像。使用实验室微型CT扫描仪(Scanco Medical AG,Brüttisellen,Switzerland)和VGStudio MAX软件(Dürr,Bietigheim-Bissingen,Germany)进行微CT检查。计算横截面图像中所有区域的总空隙面积比例,并量化矿化愈伤组织的比例。

碱性磷酸酶(ALP)测定

在每个时间点,将生物管中炖30分钟的4mL耳缘静脉血以2500r / min的速度离心。然后,除去血清的上层,用ALP测定试剂盒(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)检测下层的ALP活性。使用Beckman LX 20 Analyzer(Beckman Coulter,Inc.,CA,USA)进行测量。

苏木精 - 伊红(HE)染色

将骨样品在10%甲醛溶液中固定48小时,并在15%乙二胺四乙酸(EDTA)中脱钙3周。然后,将脱钙的样品包埋在石蜡中,切成4mm厚的切片并用梯度乙醇脱水。之后,将切片用HE染色并用光学显微镜评估。

免疫组化

将脱胶并用二甲苯溶液和梯度乙醇再水合的骨样品切片然后在高压条件下用0.01M柠檬酸盐修复溶液(pH6.0)热固定2分钟。加入100μL抗VEGF受体1(兔,1:800,ABcam,US)并孵育过夜。然后将切片与辣根酶标记的山羊抗兔IgG(北京中金金桥公司,生物技术有限公司,中国北京)孵育40分钟。然后,用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)着色剂处理切片20秒,苏木精再感染1分钟并脱水。使用MIQAS医学图像定量分析系统(Motic China Group Co.,Ltd.,Guangdong,China)分析数据,随机选择5个视野,每个视野约100个细胞。在每个领域,2)。随后,计算平均阳性面积率。

蛋白质印迹

将收获的骨样品切成片,称重并用放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液在液氮中研磨成粉末。使用蛋白质提取试剂盒(Millipore,Billerica,MA,USA)提取总蛋白质。加载等重量的蛋白质并通过十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,然后在室温下用5%脱脂乳封闭1小时。将用Tris缓冲盐水溶液(TBST,1:2500)稀释的一抗抗兔F-盒蛋白32(FBXO32)加入膜中,并在4℃温育过夜。然后将膜与山羊单克隆抗兔一起温育,第二抗体用辣根过氧化物酶(HRP,1:2000)标记,在室温下培养2小时。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)用作内部对照。使用化学发光试剂盒(Amersham,IL,USA)进行信号检测。上述抗体均购自北京中山金桥生物科技有限公司(中国北京)。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

切下骨样品并用预冷却的磷酸盐缓冲溶液(PBS)(0.01M,pH = 7.4)冲洗以除去残留的血液并称重。将PBS的比容(1:9w / w)加入到玻璃均化器中并在冰上充分研磨。将5000g匀浆物超声破碎并解冻后,将其离心10分钟并收集上清液。使用兔VEGF特异性酶联免疫测定试剂盒(TWp027731,TongWei,Shanghai,China)检测VEGF表达水平。严格遵循制造商的方案,并在450nm下测量光密度(OD)。

统计分析

所有统计分析均通过SPSS 19.0软件(SPSS,IL,USA)进行。通过方差分析(ANOVA)估计数值数据的显着差异(平均值±SD)。通过非配对t检验分析两组之间的差异。P值小于0.05被定义为统计显着性。

结果

在WO中检测到12种组合物

如表1所示,  在WO中检测到总共12种组合物。活性化合物的结构显示在附加文件2中:图S1。大多数组合物具有抗氧化,抗炎和抗菌的特性。已经证实一些组合物在骨折愈合中起关键作用,尤其是asperosaponin VI,其可以加速骨髓间充质干细胞的增殖及其向成骨细胞的分化[ 19 ]。


表格1通过LC-MS对WO进行综合分析
伤口软膏(WO)的化学表征及其对骨折修复的影响:兔模型


骨折愈合是WO组中最快的

对照组显示骨折愈合的常见过程(图  1),术后21天仍然可以清楚地观察到骨折线。在第35天,骨折线变得模糊,骨痂形成。而在YB组,骨折愈合的速度比对照组快得多。在第21天,骨折线模糊,骨折端出现大量愈伤组织。在第35天的最后一次观察中,骨折线几乎消失,但骨折重影仍然存在。在WO组,骨折的恢复率比其他两组快。在第21天,晦暗的空间非常狭窄,骨痂愈合增多。在第35天,骨折线消失,骨折的肢体几乎得到修复。如图2所示 ,微CT结果进一步验证了愈合进展,并呈现出更明显的骨折愈合情况。YB组和WO组明显优于对照组。在WO组中,骨折在第35天几乎恢复。如表2所示的骨量  ,与对照组相比,YB和WO组的体积有显着差异。WO组在第21天也显示出较大的YB组体积。结果表明,WO和YB可以在短时间内促进骨折愈合,在此期间WO具有更好的效果。


图1 通过X射线检测的WO组骨折愈合最快。对照组,云南白药(YB)组和伤口软膏组(WO)骨折愈合后第7,21和35天骨折愈合情况进行X线观察。WO集团证明是最快的骨折恢复


图2 Micro-CT检测到的WO组骨折愈合最快。对照组,云南白药(YB)组和伤口软膏组(WO)骨折后第7,21和35天骨折愈合情况的微观CT观察。在这三组中,WO组的恢复率最高

表2 uCT的骨量在7天,21天和35天

伤口软膏(WO)的化学表征及其对骨折修复的影响:兔模型

**  P  <0.01,***  P  <0.001。对照组与两个治疗组之间存在显着差异; ###  P  <0.001。YB组与WO组之间存在显着差异

WO组中组织生长最快

如图3所示 第7天,对照组出现组织坏死和反应性骨膜增生,炎性细胞聚集,毛细血管增生。在第14天,在第21天形成轻微反应的小纤维细胞,在第21天,增殖变得活跃,并且在第35天,骨愈合组织没有编织骨。与YB组一样,有骨膜反应和增殖,第7天成纤维细胞明显聚集。软骨细胞出现第14天并在第21天增殖,形成原始愈伤组织,在骨折端可观察到骨膜下骨化,软骨内骨化和原始小梁骨。在第28天,骨折与形成的大量编织骨相连。在最后一次观察中,出现了原始骨髓腔,但上下腔静脉曲张之间没有联系。同时,WO组的骨恢复过程与前14天的YB组相似。然而,在第21天出现大量骨痂并连接,第28天形成原代骨髓腔,在最后一次检查中连接骨髓腔两端。总之,WO组显示出最好的骨愈合效果。


图3 组织和VEGF在WO组中生长最快。对照组,云南白药(YB)组和伤口软膏各时间点(3,7,14,21,28和35天)骨折端血管内皮生长因子(VEGF)阳性信号HE染色WO)组。WO组显示出最佳的骨愈合效果。HE苏木素曙红

ALP浓度在WO组中最高

ALP活动是衡量自我修复能力的指标。Osteon恢复与ALP的增加密切相关。如图4所示,  血清中ALP值在三组中呈上升趋势。与对照组相比,WO组的ALP值在 第28天显着增加(P <0.01),相关现象是骨形成的惊人速度。术后35天,YB组和WO组ALP水平均较对照组显着增加(P  <0.01)。


图4 ALP浓度在WO组中最高。ALP检测在对照组,云南白药(YB)组和伤口软膏(WO)组的每个时间点(3,7,14,21,28和35天)检测到骨折组织中ALP的值。WO组增加最快,表明骨形成速度惊人。##P  <0.01,YB组与对照组; ** P  <0.01,WO组与对照组。ALP碱性磷酸酶

WO通过促进VEGF的释放来加速骨折愈合

阳性物质位于细胞质中,换句话说,粘粒库细胞质呈阳性信号(图  5))。在NC组第7天,VEGF在致密纤维结缔组织中表达高,在少数增生软骨细胞中表达低。VEGF在YB中的表达强于对照组,更多的软骨细胞表达VEGF阳性信号。WO组显示,与其他两组相比,致密结缔组织和软骨细胞中VEGF的表达均较高。在第14天,软骨增殖活跃,VEGF显着增加,而肥大软骨细胞较少,VEGF含量为阴性。在YB组中,新骨被排列成小梁,其由软骨和纤维骨组成并覆盖有成骨细胞。这些成骨细胞显示出VEGF信号的阳性表达。与YB组相比,WO组显示出相似的结果,而成骨细胞的数量更多,VEGF阳性信号也更强。在第21天,发现典型的小梁并覆盖了大量含有VEGF的成骨细胞。成骨细胞数量显着减少,但YB和WO组愈伤组织大小增加,两者之间无显着差异。28天后,对照组愈伤组织愈合,VEGF表达阴性,成骨细胞数减少。在YB和WO组,原发性骨髓腔出现,VGEF呈轻度阳性表达,WO表达水平高于YB组。在第35天,NC组处于原发性骨髓腔阶段,YB组和WO组已经发展出更多的继发性骨髓腔,其在WO组中相对更多并且显示出更高的VEGF阳性表达。在每个时间点,YB组和WO组中VEGF的表达均显着高于对照组(P  <0.01),两者均在第28天达到峰值,而对照组在监测期间逐渐增加。总之,我们可能推测WO在短时间内促进了VEGF的释放。


图5 WO通过促进VEGF的释放来加速骨折愈合。对照组,云南白药(YB)组和伤口软膏(WO)各时间点(3,7,14,21,28和35天)骨折端血管内皮生长因子(VEGF)阳性信号的免疫组化)组。** P <0.01,YB组与对照组相比; ## P  <0.01,WO组与对照组

VEGF在WO组中高度表达

免疫印迹结果期间,对照组,YB组骨折愈合和WO组进一步证实VEGF蛋白的兔的裂缝中的正则表达式(图  6的A)。在骨折愈合过程中,对照组VEGF表达水平最低,但逐渐增加。14天后,生长明显加快。在YB组和WO组中,VEGF的表达显着增强,在第28天达到峰值,然后略有下降。总体而言,YB和WO组VEGF表达显着高于对照组(P  <0.01)。结果与IHC分析一致。


图6 VEGF在WO组中表达较高。对照组,云南白药(YB)组和伤口软膏(每组(3,7,14,21,28和35天)骨折端VEGF表达的Western印迹分析(a)和ELISA(b) WO)组。GAPDH用作上样对照。** P <0.01,YB组与对照组相比; ## P  <0.01,WO组与对照组。VEGF血管内皮生长因子

ELISA的结果证实,在对照组,YB组和WO组(图VEGF蛋白的分泌  6 b)中。35天内三组的趋势与蛋白质印迹的趋势相协调。WO组中VEGF的表达较高,尤其是第28天,接近3000 pg / mL。

讨论

骨折愈合中涉及一系列生理过程,每个过程都有助于愈合过程[ 20 ]。作为影响骨折愈合的最重要因素之一,VEGF可以刺激骨折局部血管再生[ 21 ]。有许多研究表明,VEGF的应用程序可以在血管生成有效地工作,并加快骨修复的过程[ 22 24 ]。同时,建立动物骨折模型对于了解骨折修复过程具有重要价值[ 25],23,]。本研究的目的是研究WO是否能促进VEGF的表达,加速骨折愈合。我们的研究主要基于兔桡骨骨折模型。治疗云南白药或WO后,评估愈合情况,并与对照组进行比较。实验数据表明,WO通过上调VEGF的表达促进新生血管形成和愈伤组织再生,有助于加速骨折愈合。

透视和微CT在逻辑应用到评估骨折度,骨强度,以及骨折愈合的程度,因为它们的功能在定量分析骨的微体系结构[ 26,27 ]。我们在不同时间点对X射线和微CT的观察表明,就骨折愈合中愈伤组织的形成和矿化程度而言,WO组表现最佳,其次是YB组,对照组是最差的。

三组(对照组,YB组和WO组)的组织形态学分析结果显示出类似的骨形成过程。光学显微镜观察到的第一个变化是成软骨细胞的再生和透明软骨的形成。松散的结缔组织逐渐恢复到致密的结缔组织,并发展成纤维状愈伤组织。随着成骨细胞的增殖,分化和生长,骨折愈伤组织逐渐取代纤维愈伤组织。在最后阶段,破骨细胞变得活跃。骨折愈合处于重塑原始骨骼轮廓的阶段。在WO组,骨折组织形成,成软骨细胞和成骨细胞增殖,纤维愈伤组织和骨折愈伤组织重塑过程发生在骨折后3或7天,比其他组快。在WO组中观察到显着的软骨成骨和更快的新骨生长。这些证据表明,WO可以通过促进软骨成骨来加速新骨生长。IHC分析,Western blot和ELISA检测表明,YB和WO在影响VEGF表达中发挥相同作用,而VEGF在WO组中的表达强于YB组。与对照组相比,WO和YB组均能改善骨折修复不同阶段VEGF的表达,这与HE分析结果一致。VEGF组在WO组中的表达强于YB组。与对照组相比,WO和YB组均能改善骨折修复不同阶段VEGF的表达,这与HE分析结果一致。VEGF组在WO组中的表达强于YB组。与对照组相比,WO和YB组均能改善骨折修复不同阶段VEGF的表达,这与HE分析结果一致。

在本研究中,我们首次研究了WO对兔桡骨骨折模型骨折愈合过程中VEGF表达的影响。结论符合临床实践的结果。但是,仍然存在一些局限性。首先,虽然本研究的阳性对照,YB被广泛用于促进中国的骨折愈合,但对其他研究人员来说并不熟悉。关于YB如何加速骨折愈合的机制也没有被广泛报道。其次,还有一些其他蛋白质,如骨形态发生蛋白2,骨钙素和I型胶原蛋白,也有助于骨折愈合,这在目前的研究中没有研究过。在治疗期间,WO或YB是否影响这些因子的表达仍需要其他证据。此外,实际断裂条件与实验条件不同。骨折的原因非常复杂,患者之间存在很大的个体差异。骨折伴有不同的并发症,如软组织损伤,大量出血,严重疼痛,感染,内脏损伤甚至休克。因此,动物实验是不够的,WO治疗骨折的机制还需要更多的研究。

结论

总之,我们检测了WO的组成,并证实其在骨再生过程中对增加VEGF表达的作用有利于新生血管形成和愈伤组织再生,以及加速骨折愈合。本研究将加深我们对WO功能的理解,对WO的开发和应用具有重要意义。

说明:来源BMC,版权归原作者所有

        https://doi.org/10.1186/s12891-018-2236-y,仅做学术交流使用,如有侵权请联系删除!

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